基于高通量測序的設施連作果類菜根際土壤細菌群落結構和多樣性分析

姜 偉，白紅梅，薛國萍，杜金偉，高 婧，李 杰，慕宗杰，胡玉珍，宋慶成

(1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；2.赤峰市農牧科學研究院，內蒙古 赤峰 024031；3.寧城縣農牧局，內蒙古 寧城 024200)

土壤微生物作為溫室土壤生態系統中的重要組成部分，土壤中80%～90%的反應中均有微生物參與，有助于作物的營養獲取，并承擔著養分循環、分解、作物生產及病蟲害防治的作用，同時與植物保持著十分密切的互作關系[1]，因此不同蔬菜連作生產中會引起土壤微生物群落結構的變化[2]，細菌作為微生物中含量最多、豐富度最高的類群，在土壤生態過程中有著不可或缺的地位，因此加強對土壤細菌群落的研究就顯得極為重要。

截止到2016年我國設施蔬菜栽培面積達到370萬 hm2[3]。而隨著設施農業產業化和集約化的發展，許多地方出現了“一鄉一品”、“一村一品”的種植模式，蔬菜的種植種類單一，導致單一作物的復種指數增加[4-5]，加劇了土壤的連作障礙。作物的連作通常導致土壤微生物多樣性減少，使土壤細菌群落結構趨于簡化，土壤微生態環境惡化[6]，最終降低作物產量[7]。目前，土壤連作障礙已經成為限制設施蔬菜栽培可持續發展的重要因素之一[8]。研究表明，土壤微生物群落結構和多樣性除了受溫度、土壤養分、土壤類型和土壤管理等[9-10]的影響外，還包括植被類型的影響。關于土壤微生物群落多樣性與植被關系的研究主要在不同植被類型[11-12]、土地管理方式[13-14]、病害[14]、植被的不同演替階段[15]等方面，但關于設施連作不同果類菜對根際土壤微生物群落結構和多樣性影響的研究較為鮮見。本研究以露地土壤為對照，分別對比連作5 a的番茄、黃瓜、茄子、辣椒等作物的根際土壤細菌群落結構和多樣性，探討設施連作的不同果類菜是否會對土壤細菌群落造成影響，旨在從設施果類菜根際土壤微生物方面入手，為設施連作作物的生產實踐和可持續種植提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗土樣為內蒙古設施蔬菜主產區赤峰市寧城縣大城子鎮萬畝番茄基地、一肯中鄉辣椒和茄子基地、大雙廟鎮黃瓜基地連續栽培5 a的日光溫室土樣，2018年3月在大城子鎮瓦南村采集連作番茄根際土壤，2018年6月在大雙廟鎮、一肯中萬家營子村和葛家窩村分別采集黃瓜、辣椒和茄子根際土壤，所有根際土壤均在果類菜拉秧前取樣，每種果類菜取3個根際土樣，露地土壤分別在4種果類菜相鄰露地各取1份土樣，供試土樣16份。

1.2 采樣點基本情況

寧城縣位于內蒙古自治區赤峰市南部，地處燕山山脈東段北緣，處于東經118°21′26″～119°55′25″，北緯41°16′17″～41°57′53″。該地屬于溫帶半干旱大陸性季風氣候，四季分明，冬季嚴寒少雪，夏季雨量集中，多在7，8月份，春秋兩季南北氣流交互劇烈，形成多風少雨的特點，日照時數2 800～3 100 h。年降雨量430～500 mm，蒸發量約1 517 mm。試驗地從2013-2018年種植同一個蔬菜，番茄一年兩茬，越夏茬每年3月底4月初開始種植，到9月初拉秧清棚；越冬茬9月底10月初種植，翌年3月拉秧清棚。黃瓜、辣椒、茄子一年一大茬栽培，每年9月中旬至10月初定植，翌年6月初拉秧清棚。4種果類菜基肥為農家肥250 m3/hm2、氮磷鉀復合肥900 kg/hm2、抗重茬菌肥60 kg/hm2，番茄一年兩茬，追肥12次、黃瓜一年一大茬，追肥16次、茄子和辣椒一年一大茬追肥14次，盛果期每10 d追肥1次，每次施氮磷鉀復合肥和高鉀肥450 kg/hm2。

1.3 土壤樣品的采集

土壤樣品的采集采用抖根法。于2018年3，6月作物拉秧前采集各供試果類菜的根際土壤，每種蔬菜種類取3個重復，每個重復隨機取5個樣點，每樣點選取3株作物，先鏟去作物根際表層0～5 cm的土壤，取5～20 cm附著于根毛上的土壤裝入無菌自封袋后充分混勻后，裝進外旋凍存管保存液氮處理后保存在-80 ℃冰箱中，用于土壤微生物的測定。

1.4 土壤細菌的測序分析

土壤細菌DNA的提?。豪猛寥繢NA抽提微生物群落總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA，確保提取質量，用NanoDrop2000超微量紫外分光光度計選取DNA純度和含量較高的樣品進行下一步的試驗。

PCR擴增及產物的純化：使用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對16S rRNA基因V3～V4 可變區進行 PCR擴增，PCR反應條件：預變性95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個循環；然后72 ℃穩定延伸10 min，最后10 ℃進行保存。用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA純化回收試劑盒回收。PCR回收產物后，并用QuantusTMFluorometer(Promega，USA)對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：①接頭鏈接；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR擴增進行文庫模板的富集；④磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。最后將PCR產物利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

高通量測序的結果分析：本研究進行的高通量測序數據分析均基于上海美吉生物醫藥科技有限公司所提供的云服務(https：//www.https：//cloud.majorbio.com)進行，項目號為MJ20190704156. 所用到的數據分析軟件和算法參考上海美吉生物醫藥科技有限公司官方網站的說明。

2 結果與分析

2.1 不同果類菜根際土壤測序結果分析

利用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對16S rRNA基因V3～V4可變區進行 PCR 擴增測序，共得到有效序列768 560 條，平均長度447～525 bp，其中包含44個門、150個綱、364個目、575個科和1 046個屬。經篩選后，露地(CK)、番茄(T)、黃瓜(C)、辣椒(P)、茄子(E)的根際土壤樣品分別得到44 331，57 647，49 424，48 616 和41 391條高質量序列(表1)。其中稀釋曲線可以用來比較測序數量不同的樣本物種豐富度，也可說明樣本的取樣大小是否合理。由圖1可知，各處理土樣的稀釋曲線均趨于平緩，說明該測序深度包含了樣品中絕大多數細菌類型，表明測序量合理，可以用來研究細菌的群落結構。

表1 不同作物根際土壤有效序列數Tab.1 Number of effective sequences in different crop rhizosphere soils

圖1 各樣本中OTU數的稀釋曲線圖Fig.1 Sparse graph of OTUs in each sample

2.2 不同果類菜根際土壤細菌群落結構

2.2.1 不同果類菜根際土壤OTU數 由圖2可知，露地(CK)、番茄(T)、黃瓜(C)、辣椒(P)和茄子(E)的OTU總數分別為4 715，4 136，4 128，4 362，3 983。5個樣本共有的OTU數為1 584個，露地(CK)、番茄(T)、茄子(E)、辣椒(P)和黃瓜(C)特有的OTU數分別為806，217，326，312，331，其余OTU為樣本兩兩共有的。其中露地(CK)土壤樣本中特有的OTU數最多，說明該樣本中含有較多的特有微生物種類。

2.2.2 不同果類菜根際土壤細菌門水平群落結構 由圖3可知，各果類菜根際土壤優勢細菌門基本相同，其中變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota)和芽單胞菌門(Gemmatimonadota)為優勢菌門，優勢菌門占各果類菜細菌群落總數分別為露地84.56%、番茄83.02%、黃瓜82.21%、辣椒80.67%、茄子79.25%。但各果類菜中細菌門所占相對豐度大小存在差異，如變形菌門在黃瓜(C)中相對豐度最高，為31.53%，在露地(CK)中最低，為22.34%，高低次序為：黃瓜>辣椒>茄子>番茄>露地；綠彎菌門在番茄(T)處理中最高，為20.37%，在露地(CK)處理中最低，為12.47%，高低次序為：番茄>茄子>黃瓜>辣椒>露地；酸桿菌門在露地(CK)中最高，為18.98%，在番茄(T)中最低，為5.16%，高低次序為：露地>辣椒>黃瓜>茄子>番茄；放線菌門在番茄(T)中最高，為23.56%，在黃瓜(C)中最低，為4.95%，高低次序為：番茄>露地>茄子>辣椒>黃瓜；擬桿菌門在黃瓜(C)中最高，為9.34%，在番茄(T)中最低，為4.87%，高低次序為：黃瓜>茄子>露地>辣椒>番茄；芽單胞菌門在黃瓜(C)中相對豐度最高，為8.21%，在辣椒(P)中最低，為5.01%，高低次序為：黃瓜>茄子>露地>番茄>辣椒。

圖2 細菌 OTUs 分布韋恩圖Fig.2 Venn graph of bacteria OTUs distribution

圖中柱子內數據表示該物種所占百分比。The data in the column shows the percentage of the species.

2.2.3 不同果類菜根際土壤細菌屬水平群落結構 在屬分類水平，露地和4種果類菜土壤細菌相對豐度排序前15的細菌屬，通過群落組成分析，物種和樣本間相似性的豐度會進行聚類，并將結果呈現在群落Heatmap圖上，可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化來反映不同分組。在屬水平上，土壤中細菌根據豐度高低共聚成3個大簇，豐度高低次序為：第Ⅰ簇>第Ⅱ簇>第Ⅲ簇(圖4)。第Ⅰ簇包含了高豐度細菌，主要種類為norank_f__Vicinamibacteraceae、norank_f__norank_o__vicinamibacterales、norank_f__norank_o__SBR1031、芽單胞菌屬(norank_f__Gemmatimonadaceae)和norank_f__A4b，這5個屬在不同果類菜根際土壤中豐富度高低次序為：辣椒>露地>茄子>黃瓜>番茄，由深紅色變為淺粉。

第Ⅱ簇包含了中豐度細菌，不同果類菜的優勢菌群明顯不同，如鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在番茄(T)和黃瓜(C)土壤中豐富度極低(白色～淺藍色)，其他果類菜根際土壤中豐富度較高(粉色)；RB41在露地(CK)和黃瓜(C)土壤中豐富度較高(淺粉色)，而其他果類菜根際土壤中豐富度極低(淺藍色～深藍色)；MND1在番茄(T)和茄子(E)土壤中豐富度極低(淺藍色)，其他作物土壤中豐富度相對較多(粉色)；norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96在露地(CK)土壤中豐富度較高(粉色)，其他作物土壤中豐富度極低(白色～藍色)。

第Ⅲ簇包含了微豐度細菌，茄子(E)土壤中優勢菌群均存在一定程度的交疊，區域顏色相近，表明它們的群落結構相似性高，而露地(CK)和其他果類菜根際土壤的顏色變化明顯不同，說明它們的群落結構差異明顯。而且不同果類菜的優勢菌群明顯不同，norank_f__JG30-KF-CM45在番茄(T)土壤中豐富度最高，茄子(E)土壤中豐富度相對較高，其他處理中極低(白色～深藍色)；

根據細菌群落豐度組成，露地土壤和4種果類菜根際土壤的細菌物種豐度(%)可以聚成兩類，番茄(T)和茄子(E)為一類，辣椒(P)、黃瓜(C)和露地(CK)為一類，相似度較高。

2.2.4 不同果類菜根際土壤優勢菌門和優勢菌屬組間差異性 基于樣本中群落豐度數據進行露地(CK)土壤和番茄(T)、黃瓜(C)、辣椒(P)和茄子(E)等4個果類菜根際土壤進行前15種優勢門(圖5-A)和優勢屬(圖5-B)的組間差異顯著性檢驗分析，結果表明，在門水平，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、髕骨細菌門(Patescibacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota)、異常球菌門(Deinococcota)和Methylomirabilota在不同果類菜根際土壤之間有顯著或極顯著差異，其中異常球菌門(Deinococcota)差異極顯著(圖5-A)。在屬水平，norank_f__Vicinamibacteracea、norank_f__Vicinamibacterales、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、norank_f__JG30-KF-CM45、α變形菌屬(norank_f__norank_o__norank_c__Alphaproteobacteria)、RB41、norank_f__AKYG1722、norank_f__norank_o__S085和norank_f__norank_o__norank_c__S0134_terrestrial_group在不同果類菜根際土壤之間有顯著差異(圖5-B)。

圖4 不同果類菜根際根際土壤在屬水平的細菌類群比較Fig.4 Community heatmap analysis on genus level in rhizosphere soil of different treated soils

同組不同字母表示差異顯著(P<0.05) 。Different letters in the same group meant significant difference at 0.05 level.

2.3 不同果類菜根際土壤細菌多樣性分析

2.3.1 α-多樣性分析 α-多樣性指數能夠反映微生物群落的多樣性和豐富度。其中，ChaoI指數和ACE指數反映物種豐富度，Shannon指數反映群落多樣性，Simpson指數反映物種優勢度。由表2可知，與露地(CK)相比，除黃瓜(C)種植后細菌豐富度和多樣性指數降低，其他3個蔬菜均升高。稀釋后的物種豐富度指數：ChaoI指數介于3 320.79～4 039.87，ACE指數介于3 357.06～4 037.38，其中辣椒(P)的ChaoI指數和ACE指數均最高，說明種植辣椒后土壤豐富度最高。香農指數在露地(CK)和黃瓜(C)間存在顯著差異，辣椒(P)的香農指數最高，為6.82，表明了種植辣椒的土壤細菌群落多樣性最高。優勢度指數在露地和4個果類菜之間不存在顯著差異，其中黃瓜(C)處理的優勢度指數最大，為0.004 3，說明種植黃瓜后土壤優勢菌群最高，分布最為均勻。

表2 不同果類菜根際土壤細菌多樣性指數變化Tab.2 Changes of bacterial diversity index in rhizosphere soil of different fruit vegetables

2.3.2 β-多樣性分析 主坐標軸分析(Principal co-ordinates analysis)，是一種對數據進行降維的非約束性分析方法，可以反映不同樣本的群落組成相似性和差異性。由圖6可知，同種果類菜根際土壤的樣本聚在一起；而不同種類果類菜土壤的樣本分別分布在不同的區域，番茄(T)、黃瓜(C)和茄子(E)分布在PC1負方向，露地(CK)和辣椒(P)分布在正方向；此外，可以明顯看出露地和4種果類菜之間都有明顯的距離，說明土壤細菌群落組成結構不同，表明4種果類菜之間和露地的細菌群落結構差異較大。因此，該結果表明不同作物類型顯著影響土壤細菌群落構成。

圖6 不同果類菜根際土壤細菌β-多樣性的二維主坐標分析(PCoA)Fig.6 Principal coordinate analysis(PCoA)two-dimensional diagram of bacterial diversity in rhizosphere soil of different fruit vegetables

3 結論與討論

土壤微生物群落結構及群落多樣性受作物類型影響[16]，由于不同作物的生長習性不同，對土壤養分的吸收及根系分泌的不同，導致不同作物根際土壤生態微環境發生變化，進而導致細菌組成和豐富度發生變化[17]。本研究表明，與露地相比，露地因其光照、雨水、栽培管理和地表植被豐富，向土壤中歸還有機物多，所以利于土壤微生物的繁殖，因而土壤微生物量高[12，18]。本研究中露地土壤OTU數最高，說明露地有較高的土壤微生物量，與相關學者的基本一致。

通過Illumina MiSeq高通量測序技術，研究設施連作5 a的番茄、黃瓜、辣椒、茄子果類菜的根際土壤細菌群落結構和多樣性，探討設施連作的不同果類菜對土壤細菌群落結構和多樣性的影響。共獲得768 560條有效序列，其中包含44個門、150個綱、364個目，575個科和1 046個屬。對5組土樣細菌群落在門和屬分類水平上的優勢菌分布特征進行分析，發現變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門為各處理豐度較高的優勢菌，這些菌群在其他一些研究中也被認為是優勢種群[19]，這說明設施連作根際土壤具有一般土壤微生物優勢菌群組成的共性，只是占比不同。已有研究表明，變形菌門的微生物多為兼性或者專性厭氧及異養生活微生物，該門的鞘氨醇單胞菌屬有去除難降解污染物的能力[20]，酸桿菌門是土壤中的一類重要菌群，在土壤中可降解植物殘體，參與鐵循環、單碳化合物代謝以及光合作用等物質循環和生態環境構建過程[21]，可以作為較貧瘠土壤環境的指標[22]，其豐度越低，土壤質量越高。本研究中種植黃瓜處理變形菌門最高，酸桿菌門最低，分別占所有細菌群落總數31.53%和4.95%，不同果類菜的酸桿菌門豐度高低順序為：番茄>露地>茄子>辣椒>黃瓜；說明連作黃瓜根際土壤有益菌群高于其他蔬菜和露地。生產中瓜果類蔬菜連作障礙嚴重，但本研究中黃瓜的優勢菌群高于其他果類菜，這可能與試驗布置前當地前2 a采用秸稈反應堆技術改變優勢菌豐度有關。放線菌能夠分解纖維素和木質素，豐富的放線菌有利于土壤中植物有機殘體的分解[23]，本研究中連作番茄處理酸桿菌門豐度最高，放線菌風度最低，說明連作番茄土壤質量相對最差，這可能與番茄栽培模式有關，由于番茄一年兩茬次，中間沒有休閑時間導致某些菌群富集，降低土壤菌群質量。同時，各細菌門和屬分類在不同果類菜中的相對豐度存也在顯著性差異，根據露地土壤和4種果類菜細菌群落豐度組成可以聚成兩類，番茄和茄子為一類，辣椒、黃瓜和露地為一類，相似度較高，可能因為番茄和茄子根系要比其他作物根系發達，從土壤吸收養分差異導致整個土壤均屬豐度發生變化。經Alpha多樣性和Beta多樣性分析，不同果類菜的根際土壤細菌群落豐富度和多樣性存在一定的差異，與露地土壤相比種植番茄、辣椒、茄子后土壤中細菌香農指數和辛普森指數均有所提高，而黃瓜作物根際土壤與露地土壤的群落多樣性存在顯著性差異。群落豐富度和多樣性高低次序為：辣椒>番茄>茄子>露地>黃瓜，4個作物類型中群落豐富度和多樣性有差異但不顯著。從細菌在門和屬分類水平上的組成可以得知，雖然4種個果類菜群落豐富度和群落多樣性差異不大，但在細菌群落構成有顯著性差異，這可能是由于不同果類菜的根系分泌物不同，從而導致細菌群落結構的變化。上述結果與孫倩等[12]對谷子(Setariaitalica)、藜麥(Chenopodiumquinoa)、黑豆(Glycinemax)及休閑地研究結果一致，均表明不同作物根際微生物多樣性存在差異。導致的土壤微生物群落結構變化的原因有很多方面，例如栽培管理、土壤質地、種植模式等，都會造成微生物群落結構的變化[24]。近些年，許多研究認為不同作物根系分泌物導致細菌群落組成發生變化的主要原因之一[25]。

因此，與露地相比，設施連作可以改變微生物多樣性，且不同設施連作果類菜對土壤根際土壤微生物群落結構及多樣性影響不同。該項研究的微生物多樣性在對常規種植的設施連作的果類菜的相關研究尚屬首次，能夠為設施連做在內的許多農作物領域提供參考和可持續種植提供理論基礎。