電子束輻照殺菌對食用葛根粉品質的影響

徐遠芳，張祺玲，周毅吉，毛青秀，李文革，陳石新，鄧鋼橋，彭 玲,

（1.湖南省農業科學院核農學與航天育種研究所，湖南長沙 410125；2.湖南省農業生物輻照工程技術研究中心，湖南長沙 410125；3.生物輻照技術湖南省工程研究中心，湖南長沙 410125；4.中南糧油食品科學研究院有限公司，湖南長沙 410100；5.常德市犟哥生態農業科技有限公司，湖南常德 415300）

食用葛根粉是從豆科葛屬（PuerariaDC.）植物粉葛（P.thomsoniiBenth）的塊根中提取的，經過粉碎、分離、過濾、干燥而成的粉狀產品[1]。葛根是我國衛生部首批批準的藥食兩用植物，享有“南參北葛”、“亞洲人參”等美譽[2]。葛根粉中淀粉含量很高，是其主要食用成分，此外還含有豐富的異黃酮、膳食纖維、氨基酸、礦質元素等成分[3]，主要活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類成分，對心血管疾病[4?5]、糖尿病[6]、癌癥[7]等疾病有治療作用[8]。葛根粉具有潔白細膩、清香可口、淀粉糊透明度高、粘度穩定性好等特點，既可直接沖泡食用，也可加工成保健食品，市場前景廣闊[9]。葛根粉在加工儲存過程中，微生物含量容易超標，有必要對其進行合理的滅菌，以確保產品的衛生質量。

葛根粉中異黃酮類等活性成分具有熱不穩定性[10]，不適合采用傳統的高溫方法進行滅菌。輻照是一種冷加工方法，采用適宜劑量輻照能有效控制食品中污染的微生物，并且不會引起產品營養及功能活性成分的明顯破壞，是解決食用葛根粉微生物超標問題的有效方法。目前，大部分市售保健食品都是通過輻照進行滅菌的[11]。電子束輻照是輻照技術應用的重要形式，與60Co-γ射線輻照相比，電子束輻照具有操作簡單、使用安全，能量利用率高，輻照效率高，成本低等優勢[12]。近年來，隨著電子加速器設備的不斷改進和完善，電子束流的穩定性大大提高，電子束輻照技術在社會經濟效益和加工能力方面的優勢逐步顯現，有取代60Co-γ射線輻照成為輻照產業主流的趨勢[13]。關于電子束輻照技術在葛根粉輻照滅菌中的應用研究，目前國內外暫無相應的報道。

本文以食用葛根粉為對象，采用不同劑量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 k Gy）電子束進行輻照處理，以食用葛根粉中微生物存活數（菌落總數、霉菌數、大腸菌群數）、一般營養成分（水分、蛋白質、脂肪、灰分、淀粉、膳食纖維、多糖、維生素B1、維生素B2）、異黃酮類成分（葛根素、大豆苷、大豆苷元）、物理性能（白度、凍融穩定性、溶解度、膨潤力）以及抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羥自由基（·OH）清除能力、還原力）為評價指標，研究電子束輻照對食用葛根粉微生物的殺菌效果及品質的影響，旨在為電子束輻照技術在葛根粉及其相關產品中微生物的控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用葛根粉 常德市犟哥生態農業科技有限公司提供，粉狀，顏色暗白、略帶微黃；平板計數瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯 廣東環凱微生物科技有限公司；葛根素對照品（含量以99.71%計）、大豆苷對照品（含量以99.46%計）、大豆苷元對照品（含量以99.99%計） 成都曼思特生物科技有限公司；D-無水葡萄糖對照品（含量以99.8%計） 中國食品藥品檢定研究院；氯化鈉、石油醚、硫酸鉀、濃硫酸、鹽酸等分析純、正己烷（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司。

IS1020電子束輻照加工系統（10 MeV/20 kW）同方威視技術股份有限公司；MS304s/01電子分析天平 瑞士梅特勒公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；BCM-1000超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；SPX-250B生化培養箱 天津泰斯特儀器有限公司；MJ霉菌培養箱上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；KDN-12D 12孔數顯消化爐 上海洪紀儀器設備有限公司；KQ-300VDB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；KT 200 FOSS凱氏定氮儀蒸餾器 美國培安公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；SHA-CD水浴恒溫振蕩器常州澳華儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；Allgera 64低溫離心機 美國貝克曼公司；WSB-L白度計 上海儀電物理光學儀器有限公司；DW-40L508立式低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津公司；e2695液相色譜儀 美國沃特世公司；LC 20AT液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗樣品準備 將食用葛根粉用透明PE自封袋進行分裝，每袋50 g，共18份，用于微生物檢測；每袋250 g，共18份，用于理化指標檢測。樣品分裝完成后即送至輻照。

1.2.2 電子束輻照 電子束輻照在湖南湘華華大生物科技有限公司進行，電子加速器輸出功率為10 kW，電子束流掃描速率為220次/s，電子束能量為10 MeV。為保證樣品受到均勻照射，將樣品平鋪放置于電子束輻照專用金屬托盤上，厚度約3～4 cm，不同電子束輻照劑量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 k Gy）通過控制托盤在電子束下的傳輸速度來實現，輻照完成后室溫儲存待測。

1.2.3 微生物存活數的測定 按GB 4789.2-2016方法測定食用葛根粉菌落總數；按GB 4789.15-2016方法測定霉菌數；按GB 4789.3-2016方法測定大腸菌群數。

1.2.4 一般營養成分含量的測定 食用葛根粉水分含量：按GB 5009.3-2016方法測定；蛋白質含量：按GB 5009.5-2016方法測定；脂肪含量：按GB 5009.6-2016方法測定；灰分含量：按GB 5009.4-2016方法測定；膳食纖維含量：按GB 5009.88-2014方法測定；淀粉含量：按GB 5009.9-2016方法測定；維生素B1含量：按GB 5009.84-2016方法測定；維生素B2含量：按GB 5009.85-2016方法測定。

1.2.5 多糖含量的測定 根據李定芬等[14]的方法進行測定。精密稱取經105℃葡萄糖對照品0.0060 g置50 mL容量瓶中，加純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.12 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL對照品溶液置于1 mL比色管，體積不足1.0 mL者，加純水補足至1.0 mL。

精密稱取食用葛根粉0.0800 g，置于150 mL圓底燒瓶中，精密加純水100 mL，稱重，加熱回流提取1 h后取出，放冷，再次稱重，用純水補足減失重量，搖勻，過濾，棄去初濾液，精密吸取續濾液0.5 mL，備用。

取對照品溶液和供試品溶液0.5 m1置于25 mL比色管中，加水補足至1 mL，分別加入5%的苯酚溶液2 mL，搖勻，再分別加入濃硫酸7 mL，搖勻后置沸水浴中加熱15 min后取出，于冷水中降至室溫，于波長490 nm處測定吸光度。

1.2.6 異黃酮類成分含量的測定 根據常飛等[15]的方法進行測定。精密稱取食用葛根粉1.000 g，加入到50 mL容量瓶中，用30%乙醇（V/V）定容，置于40℃恒溫水浴中超聲提取60 min，冷卻至室溫，用30%乙醇再次定容，搖勻，用0.25μm濾膜過濾，濾液用于HPLC分析。分別制備葛根素、大豆苷、大豆苷元對照品的標準曲線，測定樣品中對應異黃酮類成分的吸收峰面積，以對照品的標準曲線為對照計算樣品中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量。

色譜條件：色譜柱Athena-C18（4.6 mm×250 mm,5μm），以甲醇和水為流動相，按照表1的洗脫條件進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進樣量5μL，檢測波長250 nm。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Elution conditions of HPLC

1.2.7 物理性能的測定

1.2.7.1 白度的測定 按GB/T 22427.6-2008方法測定。

1.2.7.2 溶解度和膨潤力的測定 根據侯蕾等[16]的方法進行測定。精密稱取食用葛根粉1 g（精確至0.001 g），用純水配制成50 mL質量分數為2%的葛根粉溶液，置于85℃恒溫水浴并攪拌30 min，水浴后倒入離心管進行離心(3000 r/min,15 min)，取上清液置于105℃烘箱進行烘干稱重，此部分即為水溶性葛根粉的質量，離心管中沉淀部分為膨脹葛根粉，分別按公式（1）和（2）計算葛根粉的溶解度和膨潤力。

1.2.7.3 凍融穩定性的測定 根據侯蕾等[16]方法進行測定。配制質量分數3%的食用葛根粉溶液50 mL，沸水浴15 min（加熱過程中需保持溶液體積不變），在室溫下冷卻，準確移取一定質量葛根粉糊至50 mL塑料離心管，置于?20℃低溫保存箱冷凍24 h，取出后在室溫下解凍，于4000 r/min離心20 min（如無水析出，反復凍融至有水析出），用濾紙過濾，稱取濾紙上沉淀物的質量，按公式（3）計算析水率。

1.2.8 食用葛根粉抗氧化活性的測定 根據吳瓊等[17]的方法進行樣品制備和抗氧化能力的測定。稱取食用葛根粉2.0 g，加入80 mL體積分數70%乙醇溶液，置于80℃恒溫水浴鍋中避光浸提30 min，提取液在3000 r/min離心10 min，取上清液作為抗氧化成分提取液，置于冰箱冷藏備用。

1.2.8.1 DPPH自由基清除率測定 用乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液，避光保存備用。取3.0 mL上述提取液與3.0 mL DPPH溶液混合均勻，避光放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度AX。同時，取3.0 mL乙醇與3.0 mL DPPH溶液混勻，避光放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度A0，同時以乙醇作為空白。按照公式（4）計算DPPH自由基清除率：

1.2.8.2 ·OH清除率測定 在試管中加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2.0 mL，再加入2.0 mL提取液和2.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混勻，避光置于37℃水浴10 min，于波長510 nm處測定吸光度AX。試管中以純水水代替H2O2測定吸光度AX0，以純水替代提取液測定吸光度A0，同時以蒸餾水做空白調零。按公式（5）計算·OH清除率。

1.2.8.3 還原力測定 配制0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液（phosphate buffer saline,PBS），在試管中加入PBS、提取液、質量分數1%鐵氰化鉀溶液各2 mL，混勻于50℃水浴20 min，冷卻至室溫，加入2 mL質量分數10%三氯乙酸溶液，混勻，使反應終止。取反應液5 mL于試管中，加入純水4 mL，質量分數0.1% FeCl3溶液0.5 mL，混勻并置于暗室反應30 min，于波長700 nm處測定吸光度。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 22.0軟件進行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan檢驗在P<0.05顯著水平上進行均值差異性相關性分析，結果以3次重復實驗所得數據的±s表示。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照對食用葛根粉微生物存活數的影響

食用葛根粉中初始菌落總數為2.2×103CFU/g，霉菌數為5.0×10 CFU/g，大腸菌群數為15.0 MPN/g。不同劑量電子束輻照后食用葛根粉中微生物存活數見表2，經2.5 kGy電子束輻照后，樣品菌落總數降至4.0×102CFU/g，霉菌數小于10 CFU/g，大腸菌群數為0.36 MPN/g。7.5 kGy輻照即可有效控制其微生物存活數。因此，電子束輻照對食用葛根粉殺菌效果顯著，隨著輻照劑量增加，污染微生物存活數逐漸降低。根據食用葛根粉菌落總數的對數值（lgN）與輻照劑量的擬合方程（y=?0.3731x+3.4065，R2=0.9860），求出電子束輻照對食用葛根粉菌落總數殺菌劑量的D10值為2.68 kGy。這與電子束輻照其他同類產品的研究結果相似，趙巧麗等[18]、陳志軍等[19]分別研究得出電子束輻照對松花粉、靈芝孢子粉菌落總數的殺菌劑量D10值分別為1.94和2.17 kGy。D10值是一個重要的輻照技術參數，它是指殺滅90%的微生物所需的輻照劑量[20]，即表明2.68 k Gy劑量電子束輻照可使食用葛根粉中菌落總數的存活數降低1個數量級。

表2 電子束輻照食用葛根粉微生物存活數的影響Table 2 Effectsof electron beam irradiation on mcrobial survival of ediblekudzu root powder

2.2 電子束輻照對食用葛根粉一般營養成分的影響

電子束輻照對一些食品營養成分有一定的影響，不同種類營養成分的輻射敏感性有差異，主要取決于輻照食品的種類、輻照環境和輻照劑量。由表3可知，不同劑量電子束輻照對食用葛根粉水分、灰分、蛋白質以及淀粉的含量無明顯影響（P>0.05），這與魏會惠等[21]對電子束輻照小麥粉的研究結論一致。食用葛根粉脂肪含量為0.10 g/100g，屬于低脂食品，輻照后樣品脂肪含量顯著高于對照組樣品（P<0.05），與輻照劑量無明顯的相關性。究其原因，可能是由于電子束輻照在加速葛根粉中的蛋白質氫鍵的斷裂，使其分解出部分氨基酸的同時，又加速了氨基酸的脫氨、脫羧作用，生成各種脂肪酸，從而使輻照后樣品脂肪含量增加。輻照樣品多糖含量顯著高于對照組樣品（P<0.05），2.5～10.0 kGy范圍內隨著輻照劑量增大，樣品多糖含量逐漸增加，這與朱佳廷等[22]關于輻照螺旋藻粉多糖含量變化的研究結論相似，究其原因，是由于電子束輻照使樣品中纖維素等大分子發生了降解。輻照后樣品膳食纖維的含量減少，2.5～10.0 k Gy時輻照樣品顯著低于對照組樣品（P<0.05）。李楊等[23]研究輻照對豆渣可溶性膳食纖維結構與理化性質的影響，結果發現輻照劑量增加會使膳食纖維發生降解，纖維結構變得疏松膨脹。Fernandes等[24]報道了電子束輻照后兩種干蘑菇中不溶性纖維和總纖維量顯著降低，這與本研究結論相似。維生素B1和B2都是能量代謝中不可缺少的成分。輻照對樣品維生素B1與維生素B2的含量影響不大，與輻照劑量無線性相關性。因而，采用不超過12.5 kGy電子束輻照對食用葛根粉的一般營養成分含量無明顯的破壞作用，不會影響其營養品質。

表3 電子束輻照對食用葛根粉一般營養成分的影響Table 3 Effects of electron beam irradiation on normal nutrient of edible kudzu root powder

2.3 電子束輻照對食用葛根粉異黃酮類成分的影響

葛根是我國傳統中藥，其主要有效成分是葛根素、大豆苷和大豆苷元等異黃酮類成分，以葛根素為主，也是本屬特有的活性成分，其含量約占葛根總黃酮的一半以上，因此，通常把葛根素的含量高低作為葛根質量評價的主要指標[25]。由表4可知，電子束輻照對食用葛根粉中葛根素含量的影響不大，除7.5 k Gy輻照樣品外，其余輻照樣品葛根素的含量與對照組樣品相比略有增加，10.0 k Gy時差異顯著（P<0.05），大豆苷和大豆苷元的含量變化均無顯著差異（P>0.05），結果表明電子束輻照對食用葛根粉中主要異黃酮類成分的影響不大。前期國內學者研究了不同劑量的60Co-γ射線輻照保濟丸[26]、通脈顆粒[27]及柴葛退熱散[28]等中成藥，結果表明60Co-γ射線輻照對其主要有效成分葛根素的含量均無明顯影響，這與本文的研究結論一致，但關于電子束輻照對葛根素成分影響的研究尚鮮見。徐遠芳等[29]報道了不同劑量60Co-γ射線和電子束輻照前后葛根提取物的指紋圖譜相似度均為1.0，2種輻照方式均不會影響其主要功能活性成分的質量穩定性及有效性，這與本文的研究結論相似。因此，12.5 k Gy以內劑量電子束輻照對食用葛根粉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量無明顯影響。

表4 電子束輻照對食用葛根粉異黃酮類成分的影響Table 4 Effects of electron beam irradiation on isoflavone active substances of edible kudzu root powder

2.4 電子束輻照對食用葛根粉物理特性的影響

食用葛根粉的主要成分是淀粉，葛根淀粉具有糊化溫度低、透明度高、粘度穩定性強等特點，是一種優質的食品加工原料淀粉來源。由表5可知，電子束輻照對食用葛根粉白度、凍融穩定性（以析水率計）、溶解度以及膨潤力有一定的影響。經不同劑量電子束輻照后，樣品的白度均顯著低于對照組樣品（P<0.05），但其白度值變化不大。凍融穩定性是指淀粉糊經冷凍處理，取出融化后保持原來膠體結構的特性，是判定淀粉是否有利于制作冷凍食品的重要指標之一。以析水率表征淀粉的凍融穩定性，析水率越高，凍融穩定性越差，反之越好[16]。與對照組樣品相比，輻照樣品的析水率顯著降低（P<0.05），2.5～10.0 k Gy劑量范圍內，隨著輻照劑量的增加樣品析水率逐漸下降，表明電子束輻照能顯著增強葛根粉的凍溶穩定性，從而增加其作為冷凍食品加工原料的適應性。輻照后樣品的溶解度和膨潤力均明顯增大（P<0.05），其變化與輻照劑量呈正相關，說明電子束輻照輻照使產品的溶解性增加，有利于提高產品的沖調性。目前，關于電子束輻照對淀粉功能特性的影響已有研究報道[30?31]，與本文的研究結論基本一致，可通過電子束輻照方法對淀粉進行改性。因此，采用12.5 k Gy以內電子束輻照有望改善葛根淀粉的物理性能，提高食用葛根粉的食用品質。

表5 電子束輻照對食用葛根粉物理性能的影響Table 5 Effects of electron beam irradiation on physical propertiesof edible kudzu root powder

2.5 電子束輻照對食用葛根粉抗氧化活性的影響

葛根粉中含有多種活性成分，其主要活性成分是異黃酮類和多糖，均具有較強的抗氧化活性，對DPPH自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O?2）等活性自由基具有較強的清除作用[32?33]。由表6可以看出，電子束輻照對食用葛根粉DPPH自由基清除率、羥自由基（·OH）清除率和還原力的影響不一。與對照組樣品相比，2.5～10.0 k Gy輻照樣品對DPPH自由基的清除率顯著低于對照組樣品（P<0.05），12.5 k Gy時顯著高于對照組樣品（P<0.05），但其變化與輻照劑量無明顯的線性相關關系。不同劑量輻照樣品的還原力均有所下降，5 kGy及以上劑量輻照樣品還原力顯著低于對照組樣品（P<0.05）。輻照后樣品對羥自由基（·OH）的清除率與對照組樣品相比無顯著差異（P>0.05）。本文作者前期研究了60Coγ射線和電子束輻照對葛根提取物抗氧化活性的影響，結果發現2種輻照方式對葛根提取物的DPPH自由基、羥自由基（·OH）的清除率以及還原力的無明顯影響[29]，這與本研究的結論不完全一致。分析其原因，電子束輻照對食用葛根粉中葛根素、大豆苷和大豆苷元等3種主要異黃酮類成分的含量無明顯影響，而輻照后樣品多糖成分的含量及分子構象會發生變化[34?35]，可能會對其抗氧化活性產生影響，尚有待進一步研究。因此，不超過12.5 kGy的電子束輻照對食用葛根粉中活性成分的抗氧化能力不會產生明顯的破壞作用。

表6 電子束輻照對食用葛根粉抗氧化活性的影響Table 6 Effects of electron beam irradiation on antioxidant activity of edible kudzu root powder

3 結論

電子束輻照對食用葛根粉中污染微生物具有明顯的殺菌作用，且輻照劑量越大，微生物存活數越少。電子束輻照對食用葛根粉菌落總數殺菌劑量的D10值為2.68 k Gy，對初始菌落總數為2.2×103CFU/g的食用葛根粉，7.5 kGy劑量電子束輻照即可控制其中的微生物含量。電子束輻照對食用葛根粉中一般營養成分含量（水分、灰分、蛋白質、淀粉、維生素B1和B2）、異黃酮類活性成分含量（葛根素、大豆苷、大豆苷元）以及羥自由基（·OH）清除率無明顯影響。輻照后葛根粉脂肪含量明顯增加，膳食纖維含量、白度、DPPH自由基清除率以及還原力有所降低，但總體變化幅度不大。多糖含量、溶解度、膨潤力均顯著增大，凍融穩定性明顯增強。因此，電子束輻照是一種有效的食用葛根粉滅菌方式，12.5 kGy以內電子束輻照不會對食用葛根粉的營養及功能活性成分產生明顯的破壞作用，并且有望改善其作為食品加工原料的物理性能。