生長環境對克氏原螯蝦細菌群落多樣性的影響

李雪紅，李述剛，石鋼鵬，羅小瑩，康 峻，蘇 靜，汪 蘭

（1.湖北省農業科學院，農產品加工與核農技術研究所，湖北省農業科技創新中心，農產品加工研究分中心，湖北武漢 430064；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430064；3.湖北潛網生態小龍蝦產業園集團有限公司，湖北潛江 433100）

小龍蝦學名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），是中國水產養殖中主要物種之一。近年來，小龍蝦養殖面積和養殖產量持續增長。根據2020年小龍蝦產業發展報告，2019年我國小龍蝦養殖總產量達208.96萬噸，與2018年相比，同比增長27.52%[1]。小龍蝦-稻田循環系統是小龍蝦主要養殖方式[2]，在此生態系統中，生產力、養分循環及水質離不開環境微生物的作用[3]。小龍蝦養殖系統中細菌群落組成對小龍蝦體內細菌微生物區系有很大影響，體內微生物區系在動物的營養、免疫及抗病等方面發揮重要作用[4]。池塘底泥中含有豐富的營養物質，在水生生物的生長過程中承擔著營養物質的再循環作用，因此菌落結構復雜。秦偉等[5]發現在池塘底泥中變形菌門是克氏原螯蝦的主要優勢菌群，隨著養殖時間的變化，底泥中菌群的豐富度及多樣性逐漸降低，而長毛對蝦的養殖水體中細菌優勢種群為藍細菌，芽孢桿菌在目分類水平上占有較高比例[6]。研究發現，小龍蝦攜帶的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及副溶血性弧菌等致病菌與其生活的水體環境密切相關[7?8]。

基因組測序和高通量測序（High-through putsequencing,HST）技術在描述多樣性環境中的微生物群落方面取得了突破性進展[9?10]。基因組學克服了傳統微生物分離鑒定技術，采用直接提取DNA的方法檢測微生物菌落的多樣性，利用基因組序列分析對比結果，對微生物進行生物信息學預測[11]。Illumina MiSeq測序儀已被用于16SrRNA序列研究，能夠更好地檢測和分析自然界中的次優勢菌和稀有細菌分類群[12?13]。16S rRNA高通量測序分析表明[14]，變形桿菌、類桿菌和梭桿菌是克氏原螯蝦腸道微生物區系中的優勢菌群，其中變形桿菌參與土壤中碳、氮的循環。湯純等[15]運用Illumina Miseq宏基因組探究了小龍蝦不同部位的菌相組成發現，在小龍蝦尾肉中主要微生物為希瓦氏菌屬、擬桿菌屬，并發現水體環境可能對小龍蝦攜帶的菌群多樣性影響較高。

目前關于小龍蝦微生物的研究主要集中于養殖水體中的微生物多樣性及小龍蝦腸道微生物菌落結構研究，關于生長水體及土壤對小龍蝦微生物群落的影響研究較少。本文以小龍蝦生長環境周圍的土壤及水體為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術分析生長環境中水體、土壤及小龍蝦細菌群落組成，探討養殖水體及周圍土壤中微生物群落與小龍蝦細菌群落結構多樣性的關系，為改善小龍蝦養殖環境，提高小龍蝦的食用安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）（體長8～9 cm，體重30±5 g）2018年7月、8月、9月采集于武漢農科院養殖基地；土壤2018年采集于武漢農科院養殖基地；水樣 2018年采集于武漢農科院養殖基地；微孔濾膜直徑47 mm Millipore，USA；DNA分離試劑盒QIAGENSrl Milan，Italy。

SPX-150B-Z型恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TP600梯度PCR儀 日本Takara Bio Inc；TGL-18M臺式冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和DNA的提取 小龍蝦在養殖基地采集后30 min內用冰袋運至實驗室進行處理，將蝦分為三組（C1、C2、C3），尾肉使用液氮速凍后于-80℃下冷藏用于DNA提取；小龍蝦養殖基地的土壤采集參考伍一寧[16]的方法，利用五點取樣法進行土壤采樣，去除土壤表面的植被及掉落物，取深度0～10 cm的土壤，過10目篩后混合均勻，分為五組（S1、S2、S3、S4、S5），保存于?80℃冰箱用于DNA提取；水樣使用滅菌處理后的塑料桶采集，每組樣品獨立采集三份后混合均勻[17]，于實驗室經0.22μm微孔濾膜過濾后，將濾膜轉移至無菌離心管中，分為五組（S1、S2、S3、S4、S5），于?80℃保存。按照Power Food微生物DNA分離試劑盒（QIAGENSrl，Milan，Italy）的方法進行樣品總DNA提取，將其保存于?80℃冰箱中。提取的基因組委托北京博云華康基因科技有限公司進行樣品檢測。

1.2.2 序列質控及生物信息學分析 檢測合格的樣品構建文庫，合格的文庫進行cluster制備，利用Illumina平臺（Hiseq或Miseq）進行Paired-end測序，用下機得到的數據進行相應的生物信息分析。對數據過濾，獲得高質量的Cleandata，通過reads之間的Overlap關系將reads拼接成Tags。序列拼接使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Shortreads，v1.2.11），利用重疊關系將雙末端測序得到的reads組裝成一條序列，拼接條件設置為：最長匹配長度15 bp，重疊區域允許錯配率為0.1，得到高變區的Tags。利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的Tags在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的可操作分類單元（Operational Taxonomic Units,OTU）。利用UCHIME（v4.2.40）[18]將PCR擴增產生的嵌合體從OTU代表序列中去除；使用usearch_global方法將所有Tags比對回OTU代表序列，得到每個樣品在每個OTU的豐度統計表[19]。根據每個樣品的OTU豐度文件，計算每個樣品或組別具有的OTU（不考慮OTU豐度，只考慮OTU有無），通過Venn圖，展示樣品間或組間共有及特有OTU情況。根據每個樣品OTU在每個樣品的豐度文件計算出每個OTU在每個樣品的相對豐度，利用這個豐度信息進行OTU的PCA分析；通過與數據庫進行比對，對OTU進行物種分類并分別在門、綱、目、科、屬、幾個分類等級對各個樣品作物種Profiling面積圖和柱狀圖，從綱水平開始，將物種豐度在所有樣品均低于0.5%的物種全部合并成Others。最后使用Mothur（v1.31.2）軟件計算樣品的Alpha多樣性值，包括Observed species指數、Chao指數、ACE指數，Shannon指數以及Simpson指數。前4個指數越大，最后一個指數越小，說明樣品中的物種越豐富。

1.3 數據處理

使用軟件Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）（默認）或者R軟件（秩和檢驗，Fisher’s精確檢驗，卡方檢驗，t檢驗，方差檢驗）進行組間顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 樣品測數據統計及豐度

利用測序獲得不同樣品的原始序列數據后，對序列進行拼接優化，每組樣品中測序結果統計如下（表1），小龍蝦、土壤、水體的有效序列分別為77858～95353、47921～74143、61734～90037條，進而對樣品序列進行聚類分析，在97%相似的水平下進行OTU生物信息統計，三組樣品中的OTUs總數分別為2548～2635個、3274～3737個、1789～2648個。小龍蝦中OTUs數量較土壤中OTUs數量顯著（P<0.05）減少，說明小龍蝦細菌多樣性低于土壤細菌多樣性。

表1 測序結果及質量分析Table 1 Sequencing results and quality analysis

2.2 多樣性指數分析

通過單樣本多樣性（Alpha）分析反映微生物群落的豐度和多樣性。樣品中群落的豐富度可由Observed species指數、Chao指數和ACE指數來反映[20]，簡單指群落中物種的數量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況；Shannon指數以及Simpson指數反映群落的多樣性（Species diversity），受樣品群落中物種豐富度（Species richness）和物種均勻度（Species evenness）的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性。Chao分析表明，小龍蝦中細菌群落豐富度范圍為2952～3109個，土壤中為3813～4608個，水中為2596～3922個（表2）。利用Shannon指數估算的細菌群落多樣性在小龍蝦中為5.565～5.760，在土壤中為6.008～6.767，在水中為4.364～5.206（表2）。養殖水體中的Shannon指數及Simpson指數均小于小龍蝦及土壤，說明土壤和小龍蝦中的微生物群落多樣性較水體更為豐富。

表2 各組樣品Alpha多樣性統計結果Table 2 Alpha diversity statistical results for each group

2.3 不同分類水平上的物種注釋及分析

2.3.1 基于門分類水平上的物種注釋及分析 為獲得每個OTU對應物種分類信息，對小龍蝦生長環境周圍的水體、土壤和蝦肉樣本的OTU序列進行分類匯總，對應至門、綱、目、科和屬5個水平。在所有樣品中共檢出微生物61個門類，分類至53綱、85目、83科以及74屬。

小龍蝦尾肉、土壤及水體微生物在門分類水平上的結構分布具有一定規律性：三者的優勢門類為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中變形菌門占有絕對優勢，在小龍蝦、土壤及水體中的平均相對豐度依次是54.02%、38.25%、41.94%。不同樣品類型在門分類水平上呈現出差異性，小龍蝦中梭桿菌門（Fusobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度顯著（P<0.05）高于土壤和水體；土壤中放線菌門（Actinobacteria）及藍細菌門（Cyanobacteria）相對豐度高于小龍蝦肉和水體，且差異顯著（P<0.05）；綠彎菌門（Chloroflexi）在蝦肉和土壤中相對豐度均小于1%，顯著低于水體（P<0.05）；酸桿菌門（Acidobacteria）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）在水樣中相對豐度亦顯著高于底泥（P<0.05）（圖1），以上結果說明小龍蝦蝦肉的菌落結構與養殖環境有密切聯系，而土壤中的優勢細菌藍細菌門及水體中優勢細菌綠彎菌門在小龍蝦中占比較小，說明盡管小龍蝦中的菌落結構受到生長環境的影響，但同時也有一定保守性。

圖1 基于門水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.1 Histogram of microbial composition analysis based on phylum level

2.3.2 基于綱水平上的物種注釋及分析 對微生物在綱分類水平上統計發現，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）等在小龍蝦尾肉、土壤及水體中平均相對豐度較高。在小龍蝦中，前三大優勢綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），土壤中為β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）及Saprospirae；而水體中δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）以及γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）相對豐度較高。微生物綱類在小龍蝦尾肉、土壤和水體中的相對豐度存在一定差異。小龍蝦尾肉α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）及γ-變 形菌綱（Gammaproteobacteria）的相對豐度顯著高于土壤及水體，而水體中的擬桿菌綱（Bacteroidia）及硝化螺旋菌綱（Nitrospira）則顯著較高（圖2）。

圖2 基于綱水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.2 Microbial composition analysis histogram based on class level

2.3.3 基于門、科、目水平上的物種注釋及分析 在目、科、屬分類水平上，不同樣品種類間優勢細菌的組成及豐度存在明顯差異。在蝦肉、土壤及水體中共同的優勢目（按>5%記）為伯克氏菌目（Burkholderiales），此外，優勢目、科、屬在不同樣品中各異。在蝦肉中梭桿菌目（Fusobacteriales）、甲基球菌目（Methylococcales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）顯著（P<0.05）高于土壤和水體；在土壤中，優勢目則為放線菌目（Actinomycetales和Saprospirales）；水體中擬桿菌目（Bacteroidales）、硝化螺旋菌目（Nitrospirales）和紅環菌目（Rhodocyclales）顯著高于蝦肉和土壤（圖3）。在科和屬分類水平，不同樣品種類間優勢細菌的組成及豐度差異明顯，且無共同優勢科和屬。從科水平看，小龍蝦中主要微生物菌落為梭桿菌科（Fusobacteriaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）及腸桿菌科（Enterobacteriaceae），土壤中主要微生物菌落為ACK-M 1和Chitinophagaceae；水體中主要微生物菌落為互營菌科（Syntrophaceae）、熱脫硫弧菌科（Thermodesulfovibrionaceae）以及紅環菌科（Rhodocyclaceae）（圖4）。在屬水平，小龍蝦組中的主要優勢菌株為鯨桿菌屬（Cetobacterium）、泉發菌屬（Crenothrix）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）；水體組中的主要優勢菌群為4-29、地桿菌屬（Geobacter）、HB118；土壤組中的主要優勢菌群為聚球藻屬（Synechococcus）、C39、Limnohabitans、多核桿菌屬（Polynucleobacter）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）（圖5）。

圖3 基于目水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.3 Microbial composition analysishistogram based on order level

圖4 基于科水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.4 Microbial composition analysis histogram based on family level

圖5 基于屬水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.5 Microbial composition analysis histogram based on genus level

2.4 小龍蝦、土壤和水體中具有統計學差異的菌群

除計算α多樣性外，比較微生物群落的一個主要目標是在每個樣本中找到特定細菌群。LDAEffectSize分析（Lefse），是一種用于發現和解釋高維度數據生物標識（基因、通路和分類單元等）的分析工具[21]，能夠進行兩個或多個分組的比較，強調統計意義和生物相關性，還可以分析組間菌群差異，發現各組間差異的微生物種類（圖6A和6B）。使用Lefse軟件在每個分類水平上分析細菌群落數據，LDA值為2，共區分出508個細菌群，為清晰起見，分支圖譜顯示LDA值大于2的分類群，圖6A表示三組樣品間具有顯著性差異的菌群，圖6B表示不同差異物種間的進化分支情況，綜合分析兩組圖來反映小龍蝦及其生長環境細菌群落差異物種的空間分布特征。在所有樣品中，共發現89個差異物種（圖6A），小龍蝦中共富集了31個類群，其中酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、梭桿菌屬等相對豐度明顯較高；而土壤中共富集了28個類群：酸桿菌門、擬桿菌門、綠菌彎門、厚壁菌門、梭桿菌屬、變形菌門、軟壁菌門、疣微菌門等；水體中共富集29個類群，包括酸桿菌門、擬桿菌屬、綠菌彎門、厚壁菌門、梭桿菌屬、變形菌門、軟壁菌門、疣微菌門等。

圖6 Lefse分析顯著不同的豐富分類單元Fig.6 Lefse analysesof the significantly different abundant taxa

2.5 功能預測分析

基于PICRUSt2分析平臺的16S功能預測將獲得的OTU豐度表結合基因庫對微生物的代謝通路進行功能預測（圖7）。在所有樣品中共檢測到433條微生物代謝通路，小龍蝦中細菌群落中代謝通路豐度較高的途徑主要有脂質代謝、脂肪酸合成、氨基酸合成、有氧呼吸途徑、二酰基甘油生物合成、順式戊酸酯生物合成、丙酮酸發酵途徑等；在土壤細菌中代謝通路豐度較高的途徑主要有氨基酸合成、有氧呼吸途徑、丙酮酸發酵途徑、脂肪酸合成、戊糖磷酸途徑、TCA循環途徑、核苷酸合成途徑；在水體細菌中代謝通路豐度較高的途徑主要有氨基酸合成途徑、糖酵解途徑、脂肪酸合成、脂質合成、核苷酸合成途徑等。

圖7 PICRUSt2預測微生物代謝通路豐度圖Fig.7 PICRUSt2 predicted abundance of microbial metabolic pathways

3 討論

養殖環境微生物及其菌落結構在水生生物生長過程中具有重要作用，小龍蝦體內的微生物與其營養代謝及免疫防御有密切聯系，在維持小龍蝦生長過程中內部環境穩態發揮作用[22]。對蝦腸道的微生物生態被證實與外部水環境密切相關[23]。夏海峰等[24]在研究刺參腸道與養殖池塘底泥微生物關系時發現，隨著季節的變化，二者間細菌種群變化趨勢相同，說明其菌系具有內在聯系。本研究結果顯示，小龍蝦尾肉、土壤和水體中門、綱、目、科、屬在三者間均能被檢測，表明小龍蝦的養殖環境與小龍蝦蝦肉間微生物聯系密切。在門、綱、目三個分類水平上的分布發現土壤與蝦肉間共有微生物較多，而水體分別與土壤及蝦肉間共有微生物較少，在科和屬分類水平沒有檢測到共有優勢菌群，說明在本研究中，土壤與蝦肉中微生物菌落結構在門、綱、目分類水平上密切相關，而在科和屬水平無相關性。

分析微生物群落多樣性角度可知，小龍蝦生長環境中土壤細菌豐富度和多樣性最高，而水體中的多樣性指數與小龍蝦及土壤相比明顯較低，這與凡納濱對蝦[25]、青蟹[26]等水生動物的相關研究結果一致。進一步說明小龍蝦中的微生物與生長水體及土壤關系密切，其中小龍蝦菌群的組成可能較多來源于土壤，符合孫振麗等[27]對南美白對蝦的推論，即池塘底泥對南美白對蝦腸道菌群的影響大于水體。

在運輸儲藏過程中，由于生物體內微生物作用，水產品品質會發生不同程度劣變[28?29]。在微生物中導致產品變質的微生物較少，其中對食品具有高度特異性的腐敗細菌為特異性腐敗菌。研究表明，海產品中主要優勢腐敗菌為希瓦氏菌屬（Shewanella）和假單胞菌屬（Pseudomonas），而淡水產品中主要優勢腐敗菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）[30]和芽孢桿菌（Bacillusspp）[31]。江楊陽等[32]利用高通量測序法確定淡水小龍蝦冷藏過程中的優勢腐敗菌為希瓦氏菌（Shewanella）。謝麗丹等[33]發現引起南美白對蝦腐敗變質的主要細菌是希瓦氏菌（Shewanella hafniensis）和約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）。在本研究中，不動桿菌屬（Acinetobacter）是小龍蝦的優勢腐敗菌，與先前研究的優勢腐敗菌略有不同的原因可能是生長環境、貯藏時間及溫度的差別導致。不動桿菌被證明在室溫下具有較高的脂解活性，并產生硫化氫導致蝦肉變質[34]。在水體及土壤中檢測到的優勢腐敗菌為假單胞菌屬（Pseudomonas），是水產品儲藏過程中產生異味的主要原因[35]。但兩種腐敗菌種在三組樣品中的相對豐度均較小，因此水體及土壤中的微生物會可能會在低溫貯藏過程中進行繁殖，影響小龍蝦貯藏品質。

PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）是基于16 sRNA測序數據，通過標記基因數據和參考基因組數據庫預測元基因組的功能[36]。在本研究中，基于KEGG同源基因（KO）對細菌功能進行具體注釋，結果表明蝦肉、土壤和水體共有的細菌優勢功能類群為有氧呼吸（aerobic respiration I）、脂肪酸合成（fatty acid elongation）、氨基酸生物合成（amino acid synthesis）和核糖核苷酸代謝途徑（nucleotide sugar metabolism），這可能與擬桿菌門分類下的細菌有關。楊盼等[37]發現苜蓿根際土壤中代謝為細菌菌群的主要功能，其中氨基酸代謝豐度較高；凡納濱對蝦水體中微生物功能研究結果顯示水體中微生物在細胞新陳代謝及遺傳信息處理方面功能基因豐度較高[38]。

4 結論

本研究采用高通量測序的方法研究了小龍蝦及其養殖環境水體和土壤間的微生物菌落分布發現，小龍蝦菌群與其生長環境中的土壤和水體中微生物存在密切聯系，其中小龍蝦和土壤中菌落結構與水體相比較為豐富，三類樣品擁有相對固定的優勢菌群及共有菌群，包括變形菌門、擬桿菌門等，但同樣存在差異物種，此結果為理解三者之間的關聯奠定了基礎。對小龍蝦、土壤和水體中的微生物菌群進行功能注釋表明三者間的代謝功能存在高度相似性，證實了小龍蝦菌群與其生長環境之間的相關性，其中小龍蝦菌落組成可能較多來源于土壤，而水體所含微生物對其影響較小，此研究結果對小龍蝦的運輸貯藏過程及健康養殖產業具有積極意義。但本研究尚未探討養殖水體中層水樣及下層水樣對小龍蝦菌落組成的影響，同時對三者之間菌落的關聯性未進行深入探討。