具有良好風味嗜熱鏈球菌的篩選及其產香特性分析

丹 彤，喬少婷，田佳樂

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）作為酸奶的常用發酵劑之一，廣泛應用于發酵乳制品加工中[1?2]。嗜熱鏈球菌在牛乳發酵和貯藏過程中可賦予產品優良的質地、豐富的營養價值和獨特的風味。一般認為嗜熱鏈球菌在牛乳發酵過程中能產生乳酸和一些主要羰基化合物，如乙醛、雙乙酰、乙偶姻等，可賦予產品獨特的風味[3]。

氣相色譜-質譜聯用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術始于上世紀50年代。在食品香氣成分分析研究中發揮著巨大的作用[4]。近年來，一些研究學者采用這項技術從發酵乳乳制品中檢測出多種風味物質。王偉君等采用GC-MS等技術在嗜熱鏈球菌發酵乳中鑒定出雙乙酰、2,3-戊二酮等13種風味成分[5]。任為一等采用相同的方法從嗜熱鏈球菌發酵乳檢測出3-甲基丁醛、（E）-2-戊烯醛、辛醛、己醛、（E）-己烯醛、庚醛等16種關鍵性風味化合物，并發現這些化合物對產品的風味影響較大[6]。

酸奶是消費者非常喜愛的一類具有豐富營養價值和獨特風味的發酵乳制品，然而，關于嗜熱鏈球菌在牛乳發酵過程中產生的風味物質的報道較少。本實驗在前期研究的基礎上，以科漢森公司提供的商業發酵劑為對照組，以分離自蒙古國和中國甘肅、內蒙古、新疆、青海等少數民族地區傳統發酵乳制品中的7株具有良好發酵特性的嗜熱鏈球菌為實驗菌株，采用SPME-GC-MS技術篩選出一株具有良好風味的菌株，并分析該菌株在牛乳發酵和貯藏過程中產生的揮發性風味化合物，為酸奶發酵劑的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本次實驗用菌株及其來源見表1；脫脂乳粉 美國New Zealand公司；酵母粉 美國Biosharp公司；全脂乳粉 美國Fonterra LTD公司；MRS液體培養基 美國Becton公司。

表1 實驗用菌株及其來源Table 1 Experimental strainsand their sources

7890B GC-5977A MSD型氣相色譜-質譜聯用儀，色譜柱：HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）美國Agilent公司；手動固相微萃取進樣手柄，50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 在10%（w/w）脫脂粉乳粉培養基中添加以重量計0.1%酵母粉，在溫度115℃下滅菌7 min，得到活化培養基；按照以活化培養基體積比2%的接種量，把在?80℃冷凍保藏的嗜熱鏈球菌菌株接種于所述的活化培養基中，在37℃培養24 h，然后按照MRS液體培養基體積比2%的接種量，連續傳代培養3次，使其活菌數達到108CFU/mL以上[7?8]。

1.2.2 活菌計數 利用平板菌落計數法對菌株活菌數進行測定。取1.2.1中活化三代的嗜熱鏈球菌培養液500μL于4.5 mL無菌生理鹽水（0.85%，w/w）中，充分混勻后吸取500μL液體于另一支4.5 mL無菌生理鹽水，重復該操作使菌液稀釋至適當濃度，從各試管中分別取100μL稀釋菌液，采用MRS固體培養基傾注法，于37℃倒置培養48 h，選取菌落分布適當的平板進行活菌計數。

1.2.3 發酵乳制備

1.2.3.1 全脂乳粉培養基的制備 11.5%（w/w）全脂乳粉培養基中添加以重量計6.5%蔗糖，連續均質（60℃，20 MPa）2次，95℃滅菌5 min，得到發酵培養基。

1.2.3.2 發酵條件 按照5×106CFU/mL接種量將活化后的嗜熱鏈球菌接種于滅菌后的全脂乳粉培養基中，42℃發酵，直到發酵乳的pH降低到4.5時，停止發酵，冷卻樣品，?20℃保存。所有樣品在相同的條件下進行3次平行實驗。

1.2.4 揮發性風味物質測定

1.2.4.1 樣品前處理 將5 mL發酵乳裝入15 mL樣品瓶中，在溫度55℃下平衡10 min，然后將萃取頭（50/30μm DVB/CAR/PDMS）老化后插入樣品瓶中，萃取50 min，再插入氣相色譜儀進樣口，在270℃下解吸附3 min。

1.2.4.2 氣質聯用條件 起始溫度35℃，保持5 min；以5℃/min升溫至140℃，保持5 min；再以10℃/min繼續升溫至250℃，保持5 min。載氣為He，流速1 mL/min；不分流進樣。

1.2.4.3 質譜條件 電離方式EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，質量掃描范圍35～500 m/z，發射電流100μA，無溶劑延遲。

1.2.5 揮發性風味物質的定性及定量分析 利用GC/MS工作站軟件Masshunter中自帶的NIST1.1標準庫對各組分質譜數據結果進行自動檢索，利用面積歸一化法計算各組分的相對峰面積百分比，對組分進行相對定量檢測。

1.2.6 發酵乳感官評定 由10名經過感官分析培訓的人員組成評定小組，以中國乳制品行業規范RHB 103-2004中酸牛乳感官質量評鑒細則為評定標準，對發酵乳的色澤、滋味氣味、組織狀態做出評價。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel、MetaboAnalyst 3.0網站進行多維統計分析，包括成分分析（principal component analysis，PCA）圖、熱圖等。

2 結果與分析

2.1 發酵乳中揮發性風味化合物的鑒定分析

采用SPME-GC-MS檢測發酵終點（p H4.5）時對照組和7株嗜熱鏈球菌發酵乳中的揮發性風味化合物，經NIST 11標準庫檢索各組分揮發性成分，利用面積歸一化法計算各組分相對含量。根據檢測結果可知，對照組和7株嗜熱鏈球菌發酵乳中的揮發性風味化合物種類繁多，包括酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、含氮類、雜環類及其它化合物等。其中，一些對發酵乳風味的形成有重要作用的揮發性化合物的種類和相對含量如表2所示[9?11]。

表2 發酵終點時發酵乳中的部分重要揮發性風味化合物Table 2 Some important volatileflavor compoundsin the fermented milk at the end of fermentation

比較對照組和7株嗜熱鏈球菌發酵乳中的一些重要的揮發性風味化合物后發現，不同菌株發酵乳中風味化合物的種類和含量有顯著區別。如G80-3發酵乳中乙酸的相對含量較高，而XJ17-7發酵乳中己酸的相對含量最高，達到44.74%。乙醛是發酵乳中的重要風味化合物，除QH38-6、S13-4和G80-2外，其余4株嗜熱鏈球菌發酵乳中均未檢測出乙醛。庚醛具有強烈的油脂香味[12?14]，除G80-1、QH38-6和S13-4外，其余4株嗜熱鏈球菌發酵乳中庚醛的相對含量接近或高于對照組。2-壬酮是由辛酸的β-氧化和癸酸的脫羧反應生成[15]。對照組和7株嗜熱鏈球菌發酵乳中均檢測出2-壬酮，且其相對含量高于其他酮類化合物。3-甲基丁醇可以使發酵乳具有麥芽香味[5]。S13-4發酵乳中具有較高含量的3-甲基丁醇，其次是G80-2發酵乳。己酸乙酯能賦予發酵乳類似蘋果、香蕉氣味[16]。在7株嗜熱鏈球菌發酵乳中，僅在G80-3發酵乳檢出己酸乙酯，且含量高于對照組。

2.2 感官評定結果

圖1為對照組和7株實驗菌株發酵乳感官評定的結果。G80-2、S13-4、MGB82-2的感官評分接近于對照組，特別是G80-2的滋味和氣味得分（35.8）與對照組（35.9）最接近，因此，選擇G80-2作為實驗菌株進一步分析該菌株從牛乳發酵到貯藏期間產生的揮發性風味物質的動態變化規律。

圖1 對照組和7株嗜熱鏈球菌發酵乳感官評定結果Fig.1 Sensory evaluation results of control and 7 groupsof fermented milk

2.3 發酵乳中風味物質的主成分分析

發酵終點時對照組和7株嗜熱鏈球菌發酵乳中的揮發性風味化合物PCA分析結果如圖2所示。以發酵乳中揮發性風味化合物種類和含量的相似度為聚集依據，根據圖中聚集度，可將對照組和7株嗜熱鏈球菌發酵乳大致聚為3個類群，分別為G80-2S13-4JD類群、G80-3MGB82-2類群以及QH38-6G80-1XJ17-7類群。G80-2S13-4JD類群中，G80-2與對照組之間的距離最近，說明G80-2發酵乳中的揮發性風味化合物組成及含量都最接近對照組，這一結果與2.2中感官評定的結果相一致。

圖2 發酵乳中揮發性風味化合物的PCA分析Fig.2 PCA analysis of volatile compounds in fermented milk

2.4 G80-2發酵乳中的揮發性風味化合物及動態分析

以G80-2為實驗菌株，利用SPME-GC-MS檢測牛乳從發酵到貯藏期間發酵乳中揮發性風味化合物的動態變化，一些重要的風味化合物如表3所示。

表3 嗜熱鏈球菌G80-2發酵乳中揮發性風味物質的SPME-GC-MS鑒定結果Table 3 Volatile flavor compounds in fermented milk of S.thermophilus G80-2 by SPME-GC-MS

2.4.1 酸類化合物鑒定分析 酸類化合物通常是由乳中脂肪被脂肪酶分解得到[17]。本實驗中檢測到的酸類化合物主要有乙酸、己酸、庚酸及辛酸。乙酸是乳酸菌發酵產生的重要酸類物質之一，可以賦予發酵乳酸爽的風味[18]，在發酵（4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間其相對含量分別為0.23%、1.02%、1.93%、2.58%、1.47%、2.04%和1.38%，整體呈先上升后下降趨勢。辛酸具有微弱的水果淡酸味[19]，在發酵（2、4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間其相對含量分別為0.20%、0.82%、1.34%、1.30%、1.11%、1.15%、2.25%和1.68%，于貯藏中期（7 d）相對含量到達頂峰。此外，重要的酸類化合物還有己酸，己酸具有酸味、脂肪味以及乳酪味[19?20]，在貯藏期間具有較高的相對含量，對發酵乳的滋味影響較大。

2.4.2 醇類化合物鑒定分析 醇類化合物一般由醛、酮以及氨基酸作用產生[21]。本次實驗中測得的醇類化合物主要有3-甲基丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇等。在這些醇類化合物中，一些低分子醇在發酵（2、4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間的相對含量較高，如1-己醇相對含量分別為5.41%、4.01%、5.00%、5.16%、4.19%、3.88%、4.77%和4.17%；而1-庚醇的相對含量分別為7.41%、4.84%、5.48%、6.12%、4.82%、4.78%、5.82%和5.27%。盡管有很多關于醇類化合物的報道，但至今為止醇類化合物對發酵乳風味的影響機理還不清楚。

2.4.3 酮類化合物鑒定分析 酮類化合物的風味閾值很低，較低的濃度能對發酵乳的風味產生重要影響。本次實驗檢測得到的主要酮類化合物有雙乙酰、2-戊酮、乙偶姻、2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮等。大多數研究認為酮類化合物一般是由不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解以及微生物代謝幾個途徑形成[22?23]。本實驗檢測到雙乙酰和乙偶姻的相對含量較高，在發酵（2、4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間雙乙酰的相對含量分別為2.12%、10.26%、9.76%、20.29%、14.49%、13.89%、14.83%和11.34%，在發酵終點（0 d）時含量到達最高值，在貯藏期間相對含量下降較為明顯，這主要原因是雙乙酰在貯藏過程中容易被還原為3-羥基-2-丁酮[24]。

2.4.4 醛類化合物鑒定分析 和酮類化合物類似，醛類化合物一般閾值較低，對發酵乳風味構成有重要影響[24?26]。本次實驗檢測得到的主要醛類化合物有乙醛、正戊醛、庚醛、苯甲醛等。乙醛是發酵乳中重要的特征風味物質，一定濃度范圍內的乙醛可以賦予酸奶清爽的香味[27?28]。目前國內大部分發酵乳都是以乙醛為主要風味的醛香型發酵乳[29?30]。本實驗在發酵（4、6 h）和貯藏（0、1、3、7、14 d）期間均檢測到乙醛，且乙醛的相對含量較高，分別為5.45%、4.56%、3.45%、2.25%、2.78%、2.61%和1.84%。乳酸菌可通過多種代謝途徑生成乙醛，本實驗中乙醛的相對含量呈逐漸降低的趨勢，這可能是因為受到貯存條件的影響，低溫及乙醛生產相關的基因表達降低，影響發酵乳中乙醛的產量。

2.4.5 酯類化合物鑒定分析 酯類化合物是發酵乳中的重要揮發性化合物，主要通過脂肪酸水解和微生物代謝產生。一般來說，一些分子量較低的酯對發酵乳的風味影響較大，如本次實驗檢測到的甲酸乙烯酯，具有水果和花香味，能極大限度地降低脂肪酸和胺帶來的苦味[31?32]。

2.5 不同時期發酵乳中揮發性風味化合物的熱圖聚類分析

利用熱圖對G80-2在牛乳發酵和貯藏過程中產生的揮發性風味物質進行聚類分析，結果如圖3所示。根據熱圖的垂直方向，將所有樣品分為兩大類，發酵期（2、4、6 h）與貯藏期（0 d）樣品聚為一類，而貯藏期（1、3、7、14 d）聚為一類。在貯藏期樣品中，貯藏期（1、3、7 d）樣品聚為一類，而貯藏14 d樣品單獨聚為一類。這可能是因為貯藏14 d樣品中嗜熱鏈球菌大量死亡，樣品中風味化合物的種類和相對含量與貯藏期（1、3、7 d）有明顯區別。在發酵期樣品中，發酵初期（2 h）樣品單獨聚為一類，發酵中后期（4、6 h）及貯藏期（0 d）聚為一類，說明發酵初期（2 h）樣品中揮發性風味化合物的構成明顯不同于發酵中后期（4、6 h）及貯藏期（0 d）樣品。這可能是因為發酵初期（2 h）發酵乳中嗜熱鏈球菌活菌數較低，產生的風味化合物的種類和相對含量相對較少，而發酵中后期（4、6 h）及貯藏期（0 d）隨著發酵乳中活菌數的增加，產生的風味化合物的種類和含量逐漸增加，較多的香氣成分帶給發酵乳更好的風味和感官質量。

圖3 不同時期發酵乳的熱圖及聚類分析Fig.3 Heat map and cluster analysis of fermented milk in different periods

3 結論

以科漢森公司提供的商業發酵劑為對照組，從分離自傳統發酵乳制品中的7株嗜熱鏈球菌中篩選出一株具有良好風味的菌株G80-2，并對該菌株在牛乳發酵和貯藏期間產生的風味化合物進行檢測分析。結果表明，嗜熱鏈球菌G80-2在牛乳發酵和貯藏期間產生多種風味化合物，其中酸類化合物4種、醇類化合物10種、酮類化合物12種、醛類化合物6種、酯類化合物1種，且一些主要特征風味物質如乙酸、乙醛、雙乙酰、乙偶姻、2-庚酮、1-庚醇等相對含量較高，對發酵乳風味的形成發揮了重要的作用。熱圖聚類分析的結果表明，發酵和貯藏期間發酵乳中揮發性風味物質差異較大，說明隨著發酵時間的延長，發酵乳中的揮發性風味物質差異顯著。