北京棒桿菌天冬氨酸激酶五突變體的構建及酶學性質表征

王哲人，劉曉婷，樊占青，王亞南，魏 貞，高 欣，方 麗，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春 130118）

天冬氨酸族氨基酸包括蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）、甲硫氨酸（Met）及異亮氨酸（Ile）[1]，是人體必需氨基酸，其生物合成途徑中首個關鍵別構酶是天冬氨酸激酶（aspartake kinase，AK）[2]，受Thr和Lys的反饋或協同反饋抑制作用[3?4]。不同生物體中，AK的存在形式和抑制機制不同[5]，大腸桿菌中有三種形式AK酶，分別為兩種雙功能天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶（AKI-HSDHI、AKII-HSDHII）和一種單功能AK（AKIII）[6]，其中AKI-HSDHI活性受Thr反饋抑制[7]，AKII-HSDHII活性不受任何天冬氨酸族氨基酸抑制[8]，AKIII活性受Lys的反饋抑制[9]。擬南芥中含有5種形式的AK，包括3種單功能酶AKI、AKII、AKIII和2種雙功能酶AKI-HSDHI、AKII-HSDHII[4]。其中AKI受Lys和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）協同反饋抑制[10]，AKII和AKIII僅受Lys抑制[11]，AKI-HSDHI和AKII-HSDHII受Thr抑制，且AKII-HSDHII還受到亮氨酸（Leu）的抑制作用[12]。據文獻報道，北京棒桿菌天冬氨酸激酶（CorynebacteriumpekinenseAK，CpAK）是一種單體變構酶，受Thr和Lys協同反饋抑制[13?14]，限制天冬氨酸家族氨基酸的積累。因此，本實驗選擇只含有一種單體AK的北京棒桿菌中CpAK為研究對象，試圖削弱或解除Thr和Lys的反饋抑制作用，為提高酶活力和增加天冬氨酸族氨基酸產量提供理論依據。

趙智等[15]構建含AK的重組質粒，提高AK酶活力和Lys產量。秦天宇[16]通過表達高絲氨酸脫氫酶的hom基因和AK的lysC基因并敲除McbR，提高Met產量。Shaul等[17]發現在大腸桿菌突變株中，AK基因表達時，Thr大量積累，因此突變能解除反饋抑制作用，提高下游產物產量，此研究為如何提高Thr產量和通過突變對AK進行改造提供理論基礎。Ohnishi等[18]將谷氨酸棒桿菌AK Thr311突變成T311I后，Lys產量有所提高。Chen等和Curien等[19?20]對谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌中AK別構抑制劑結合位點進行突變，獲得削弱Thr和Lys協同反饋抑制的突變體。Ayako等[21]在對谷氨酸棒桿菌天冬氨酸激酶（Corynebacterium glutamicumAK，CgAK）結構研究的基礎上，提出Thr/Lys結合誘導了ACT結構域從而關閉催化結構域中的活性位點，此研究為抑制劑Thr/Lys結合的多突變株構建奠定基礎。

目前主要通過對抑制劑結合位點[22?24]、底物結合位點[25]和ATP結合位點[26]對北京棒桿菌天冬氨酸激酶（CpAK）進行改造。對于結合位點的改造主要是構建單、雙[27]、三[28]、四[29]突變體，五突變體的構建和改造鮮有報道。本研究在實驗室前期構建的四突變體T379N/A380C/G171I/Y 198NAK（NCIN AK）基礎上，提取其重組質粒，進行定點飽和突變，轉入宿主BL21大腸桿菌感受態中，通過高通量篩選出酶活力顯著提高的突變株，進行基因測序，測序成功后即構建五突變體成功。前期實驗室四突變體NCIN AK是對與抑制劑Lys結合位點[13,22]、與底物結合位點、與ATP結合位點[30]的疊加飽和突變，所以本實驗在四突變體NCIN AK基礎上，對與抑制劑Thr結合的關鍵殘基位點進行疊加飽和突變，構建五突變體，以期獲得酶活力提高更多，酶學性質更好的突變體。通過同源序列比對并分析單體Cp AK，發現位點Gly295位于Thr周圍，且該位點高度保守，對位點Gly295進行定點飽和突變，構建五突變體T379N/A380C/G171I/Y 198N/G295L（用突變后氨基酸的字母縮寫命名，簡稱NCINL AK），旨在提高AK酶活力并解除反饋抑制作用，增加天冬氨酸族氨基酸產量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組四突變體質粒p ET-28a-NCIN-AK、E.coliBL21（DE3） 均由吉林農業大學發酵工程實驗室提供；Taq酶、DpnI酶、質粒提取試劑盒 大連TaKaRa公司；50×TAE Buffer 大連美侖生物技術有限公司；HRPMouse Anti-6x His BD公司；IPTG、卡那霉素、SDS-PAGE試劑盒 北京鼎國生物公司；Ni SeharoseTM6 Fast Flow 美國GE公司；LB液體培養基（100mL） 實驗室自制。

梯度PCR儀 德國Eppendorf AG公司；Spectra Max 190酶標儀 美國Molecular Devices公司；Thermo Fisher高速冷凍離心機 德國奧斯特羅德公司；SE260蛋白電泳儀 美國GE公司；瓊脂糖凝膠成像儀 美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 設計引物和定點突變 利用Primer Premier 5.0軟件為四突變體AK的295位點進行引物設計，五突變體NCINLAK上游引物及下游引物如表1。引物合成由庫美生物有限公司完成。利用試劑盒提取質粒pET-28a-NCIN-AK，以其為模板進行突變PCR擴增，反應體系及條件見張芷睿等的方法[24]，將PCR產物進行1%瓊脂糖核酸電泳驗證，并于4℃保存。

表1 G295位點的突變引物Table 1 Mutation primer of G295

1.2.2 構建突變體重組質粒 將1.2.1中驗證成功的PCR產物用DpnI酶消化2 h，將5μL消化產物導入120μLE.coliBL21感受態細胞中，反應條件為：將二者混合物預冷10 min，42℃金屬浴90 s，再冰浴0.5 h，吸取900μL LB液體培養基加到處理之后的混合物中，在37℃，180 r/min條件下培養1.5～2 h，7000 r/min離心3 min，去掉800μL上清液，混勻剩余培養基和菌體后，將其涂布于有卡那抗性的LB固體培養基上，37℃培養箱過夜培養。

1.2.3 高通量篩選及AK基因驗證 將平板上全部單菌落轉接到含卡那霉素的LB液體培養基中，在96孔板中培養8～10 h后加入1 mmol/L的IPTG過夜誘導表達9 h。高通量篩選的方法及條件參考張芷睿等[24]。擴大培養篩選后酶活性有較大提高的突變株，培養條件為37℃、180 r/min，9～13 h。對培養后的菌體進行菌液PCR擴增，反應體系及條件參考Han等[13]，對菌液PCR產物進行核酸電泳驗證，將驗證成功的菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，確定基因是否突變成功。

1.2.4 AK蛋白誘導表達及純化 將活化后的野生型和突變體菌株，以1:50的比例轉入100 mL LB液體培養基中，37℃、210 r/min培養1～1.5 h，加100 μL的IPTG，130 r/min過夜誘導9 h。4℃、8000 r/min離心10 min，倒掉上清液，加入10 mL PBS緩沖液，將其與菌體反復吹打混勻。制備粗酶液和純化液的方法見任軍等[3]，對野生型菌株和五突變株進行誘導表達，經離心、超聲破碎、過膜得到WTAK和NCINL AK的粗酶樣，將粗酶樣經過鎳柱（含有His標簽）處理得到純化樣。參考文獻Han等[13]方法步驟，進行SDS-PAGE和Western Blot驗證，分析所得的粗酶液和純化液中AK蛋白是否表達成功。

1.2.5 AK酶活力測定 以L-天冬氨酸為底物，參考文獻陳志杰等[23]的酶活測定方法及反應體系，對野生型AK和突變體AK的純化液進行酶活力測定，控制反應體系的其他條件不變，加入50μL純化液，在不同底物濃度（0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L）下25℃、130 r/min反應30 min后，在波長540 nm處測其吸光值，并計算AK的酶活力，利用OriginPro 8.5軟件對計算出的AK酶活力進行非線性擬合。

1.2.6 AK酶學性質的分析

1.2.6.1 酶的最適溫度反應體系 其他條件不變，在不同溫度（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50℃）下130 r/min反應30 min，每個樣品3次平行，最高酶活為100%，此時對應的溫度為酶的最適溫度。

1.2.6.2 酶的最適p H反應體系 其他條件不變，用濃鹽酸調節Tris-HCl溶液p H（6.0～10.0，設置10個間隔，每兩個值相差0.5），25℃反應30 min，在波長540 nm處測其吸光值，計算AK相對酶活力（某個pH時所測吸光值與同時期另一個pH所測出最大吸光值之比，用以確定最適pH），每個p H 3個平行，最高酶活為100%。

1.2.6.3 酶的穩定性 在最適溫度和最適pH條件下，將50μLAK純化液加入反應體系[23]中，每隔1 h測定1次酶活力，連續10 h，每個樣品3個平行，0 h相對酶活力為100%。

1.2.6.4 底物抑制劑 將不同濃度（0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）的底物抑制劑Lys、Thr、Met、Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met、Lys+Thr+Met加入到反應體系中，研究底物抑制劑對AK酶活力的影響，每個樣品3個平行，對照組沒有底物抑制劑，相對酶活為100%。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次或3次以上，結果以x±s表示，采用SPSS 19.0軟件對實驗結果進行統計學分析并用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 Thr關鍵結合位點的確定

通過Clustal X 1.83、ESPript 3.0進行同源序列比對并用Discovery Studio 4.5軟件對AK單體模型中抑制劑Thr周圍5?范圍內關鍵殘基位點分析，找出與Thr結合的關鍵殘基，如圖1B、1C所示，Gly295位點（圖1C中Gly295用簡寫G295表示，其中G是氨基酸Gly的簡寫，圖1B中各個氨基酸位點表示同理）與Thr形成氫鍵，其它殘基也與抑制劑之間存在較強的相互作用，Gly295與周圍氨基酸共同作用于Thr，有穩定Thr的作用。同源序列比對結果顯示，Gly295位點高度保守，如圖1A所示。Gly295位點可能有重要作用，猜想改變Gly295位點與Thr之間的作用，可能會使抑制劑結合方式改變，從而達到本研究的目的。

圖1 Thr結合位點的篩選Fig.1 Selection of Thr binding sites

2.2 突變體NCINL AK的構建

核酸電泳結果如圖2A中泳道2所示，單一明亮條帶在7000 bp附近，大小與質粒pET-28a-AK（6822 bp）相符，證明質粒實現大量復制，初步說明突變成功。擴大培養高通量篩選獲得的高活性突變體AK菌株。如圖2B所示，單一明顯條帶大小在1400 bp左右，與野生型AK（1453 bp）基本一致，證明篩選的重組菌株中有AK基因。如圖2C所示，五突變體NCINL AK氨基酸序列中295位點由甘氨酸（Gly）突變成Leu，證明五突變體NCINL AK構建成功。

圖2 五突變體NCINL AK的構建Fig.2 Construction of thefive-point mutant NCINL AK

2.3 SDS-PAGE和Western Blot驗證

分別對WTAK和NCINL AK的粗酶樣和純化樣進行SDS-PAGE及Western blot蛋白電泳驗證，結果如圖3所示，1～6泳道在48 k Da處均有單一蛋白條帶，說明目的蛋白表達成功。WT AK表達的蛋白條帶比NCINL AK顏色深，說明NCINL AK蛋白表達量較WT AK低。可能是突變使單體AK空間結構發生變化，導致AK蛋白表達能力降低。

圖3 SDS-PAGE 及Western blot 結果Fig.3 Results of SDS-PAGE and Western blot

2.4 反應動力學結果

如圖4和表2所示。五突變體NCINL AK的最大反應速率Vmax為259 U/（mg·min），較WT AK Vmax（2.97 U/（mg·min））提高87.20倍；WTAK的反應動力學符合Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn），且n值為2.73（大于1），表明AK為典型的別構酶且呈正協同性[30]，五突變體NCINL AK的n值為1.21，較野生型低，表明突變后正協同性降低；NCINL AK的Km值為0.93，明顯低于野生型，表明突變后與底物親和力增強。五突變體NCINL AK的n、Km值均低于四突變體NCIN AK，表明突變后五突變體與底物親和力更強，且酶活力也高于四突變體，可能是因為295位點突變后，由原來的Gly變為Leu（圖5，其中Gly用簡寫G表示，Leu用簡寫L表示），R基側鏈增長，在一定程度上破壞了與抑制劑Thr之間的非共價作用力，減弱了其與抑制劑的結合，從而增強其與底物的結合能力，說明在四突變體NCIN AK的基礎上繼續改造獲得良好效果。

圖4 WT AK和NCINL AK的反應動力學結果Fig.4 Reaction kinetic resultsof WTAK and NCINL AK

表2 WTAK和NCINL AK的反應動力學參數Table 2 Reaction kinetic parameters of WT AK and NCINL AK

圖5 G295位點突變前后與Thr位置之間的變化Fig.5 Changes before and after G295 site mutation and Thr position

2.5 野生型AK和突變體AK酶學性質表征

2.5.1 溫度和p H對酶活的影響 由圖6A可知，五突變體NCINL AK最適溫度為28℃，突變后五突變體最適溫度較野生型和四突變體提高3℃，當溫度在28～50℃范圍內時，酶活力隨溫度升高而下降，突變體NCINL AK酶活力高于此溫度下野生型和四突變體，在50℃時，其相對酶活力仍能保持在57%以上，說明突變后AK酶表現出良好的耐高溫性能。可能是由于突變后，酶與底物的結合更為緊密，使得催化效率提高，即使在高溫條件下，仍不能破壞酶與底物的連接，所以酶活性降低的程度減慢，宏觀表現為耐高溫性增強。

圖6 WTAK、NCIN AK和NCINL AK的酶學性質表征Fig.6 Characterization of enzymatic properties of WTAK,NCIN AK and NCINL AK

由圖6B可知，WT AK最適pH為8.0，突變體NCINL AK最適pH為8.5，突變未改變酶的最適pH，但pH在6.5～7范圍內時，相對酶活力在60%以上，表現良好的耐酸性。低pH條件下高酶活力對發酵生產氨基酸有利。

2.5.2 AK的穩定性分析 在反應溫度28℃和p H8.5條件下，對野生型AK和突變體AK穩定性進行測定，如圖6C所示，突變體NCINL AK的半衰期為5.2 h，較野生型AK延長了0.5 h。8～10 h時，突變體NCINLAK酶活力較野生型和四突變體下降緩慢，直到10 h酶活力仍在25%以上，比野生型AK更穩定，也改善了四突變株半衰期縮短的情況，表明五突變體AK穩定性更好。

2.5.3 底物抑制劑對AK活力的影響 由表3、表4可知，在抑制劑Lys、Thr或Met單獨存在時，Lys或Thr對WT AK的抑制作用強于Met。濃度為10 mmol/L的Lys+Thr對WT AK的抑制作用最大，約為73%，說明AK受Lys和Thr的單獨和協同抑制。五突變體NCINL AK在不同濃度Lys存在時被明顯激活，激活作用與抑制劑濃度呈劑量依賴關系，最大激活作用可達114.79%，較四突變體NCIN AK提高5.48%，表明對抑制劑Thr結合位點的突變使AK酶活力進一步提高。NCINL AK在Thr濃度為10 mmol/L時被明顯激活，相對酶活力為100.25%，NCINL AK的相對酶活力均高于同濃度抑制劑Thr條件下的WT AK和NCIN AK，說明突變能減弱甚至消除抑制劑Thr的抑制，與本實驗的選點依據一致。當2種抑制劑同存在時，不同濃度的Lys+Thr條件下，激活作用隨濃度增大而增大，說明突變后協同反饋抑制作用減弱，這與反應動力學結果n值減小一致。當3種抑制劑同時存在時，NCINL AK被明顯激活，最大酶活可達131.57%。以上研究結果表明，疊加飽和突變能有效解除反饋抑制，NCINL AK在Lys或Thr單獨存在時，均表現出激活作用，但NCIN AK在Thr單獨存在時無激活作用，說明當抑制劑Lys和Thr結合位點都突變時，不同濃度的Lys和Thr均產生激活作用，這與本研究目的相符。不同配體周圍關鍵殘基位點的疊加突變效應具體機制有待進一步研究。

表3 不同底物抑制條件下WTAK和NCINL AK的相對酶活力（%）Table 3 Relative enzyme activity of WT AK and NCINL AK under different substrate inhibition conditions (%)

表4 不同底物抑制條件下NCIN AK和NCINL AK的相對酶活力（%）Table 4 Relative enzyme activity of NCIN AK and NCINL AK under different substrateinhibition conditions(%)

3 結論

本實驗在北京棒桿菌天冬氨酸激酶（CpAK）四突變體NCIN AK的基礎上，對抑制劑Thr結合位點Gly295進行定點飽和突變，成功構建五突變體NCINL AK。酶動力學結果顯示，NCINL AK的相對酶活力較WT AK提高87.20倍，且高于NCIN AK，n值減小，呈正協同性降低，Km減小，增強了其與底物的親和力。酶學性質研究結果表明：NCINL AK最適反應溫度提高3℃，pH在6.5～7范圍內時，酶活力高于WT AK和NCIN AK，相對酶活力在60%以上，半衰期由4.7 h延長至5.2 h，且改善了NCIN AK半衰期減小的情況，表現出較好的穩定性。NCINL AK在一些濃度抑制劑作用下有明顯激活作用，不同濃度Lys條件下，抑制作用被完全解除，且不同濃度Thr條件下，抑制作用被部分解除，這表明五突變體能基本解除Lys、Thr對AK的反饋抑制作用，為解除末端產物對Cp AK的反饋抑制作用提供理論依據。本研究為優化CpAK代謝途徑及構建對高溫、酸性友好的高產天冬氨酸族氨基酸工程菌提供參考，為天冬氨酸族氨基酸大量積累提供可能。