雙菌種混合發酵制備富含γ-氨基丁酸酸奶工藝優化

孫世鑫，李 科，駱鵬飛，俞蘭秀，莫小葉，孫海燕，劉 冬,

（1.深圳職業技術學院深圳市發酵精制檢測系統重點實驗室，廣東深圳 518055；2.綠雪生物工程（深圳）有限公司，廣東深圳 518055）

γ-氨基丁酸又名γ-氨酪酸、4-氨基丁酸，是一種在動植物體內廣泛存在的小分子量非蛋白質氨基酸。作為哺乳動物重要的抑制性神經遞質[1]，GABA在日常代謝和神經調節中發揮著巨大作用：如可通過GABAA受體改變神經突觸后膜對Cl-的通透性來發揮鎮定安神的功效[2]，或通過對血管緊張素轉換酶的高效抑制來降低血壓[3]等。2009年9月，我國正式批準GABA為新資源食品，允許其在除嬰幼兒食品之外的飲料等食品中添加使用，且攝入量不超過500 mg/d[4]。

當前，功能性酸奶已經成為乳制品開發的主流。如具備安神助眠功效的酸奶，即可通過直接發酵法[5]制備。在生產中，向乳液內添加在乳基底物中具備較高GABA合成活性的乳酸菌，在發酵的同時利用其胞內的谷氨酸脫羧酶（Glutamate Decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15）催化L-谷氨酸或其鈉鹽，經GABA支路脫羧合成GABA[6]，即可直接生產出天然富含GABA的功能性酸奶。研究結果表明，經口服攝入的GABA能夠由消化道進入血液循環[7]，發揮舒緩焦慮[8]、抗解壓力[9]和改善睡眠[10]等保健作用。此外，有研究證實，富含GABA的功能性酸奶在感官指標方面與傳統酸奶無顯著差異，且乳酸菌活菌數和GABA含量在酸奶保質期內能夠保持相對穩定[11]。因此，篩選在乳基底物中具備較高GABA合成活性的乳酸菌并優化其GABA生產工藝具備重要的經濟意義。

本研究利用課題組前期從國內市售奶酪、奶疙瘩等發酵食品中篩選得到的在乳基底物中具備高產GABA潛力的乳酸乳球菌乳酸亞種等菌種，以脫脂復原乳液為主要原料，通過單菌種發酵及雙菌種發酵的單因素實驗，確定了菌種在乳基環境中的最適發酵條件；利用均勻實驗構建出雙菌混合發酵過程的模型方程，確定了優化后的混合發酵工藝參數，以期為更多富含GABA發酵乳制品的開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GABA高產潛力菌種乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis，菌種編號4043）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus，菌種編號1060）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，菌種編號1134）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，菌種編號1443） 實驗室保藏；培養基：MRS肉湯培養基和平板培養基、M 17肉湯培養基和平板培養基 實驗室自制；脫脂乳粉市售；四氫呋喃、甲醇、乙腈 色譜純，天津大茂化學試劑廠；L-Glu-Na（生化試劑純） 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

5810R型高速冷凍離心機 德國Eppendoff公司；LC-20AT型高效液相色譜 日本Shimadzu公司；PHS-3C型p H計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制MRS肉湯培養基和M 17肉湯培養基：蒸餾水混勻后調節pH為7.2±0.1，121℃滅菌15 min。

發酵乳液：用純水溶解乳粉，配制成10%（w/v）的乳液，按照實驗所需質量濃度加入適量L-Glu-Na[12]，混勻后分裝入100 mL錐形瓶，97℃水浴滅菌15 min后冷卻至室溫備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 單菌種最適發酵溫度的確定 取活化后的4043號菌種子液，按3%（v/v）比例接種于L-Glu-Na質量濃度2 g/L的發酵乳液中，分別于28、30、34、37、40℃下恒溫發酵48 h，隨后測定發酵終點酸奶的酸度、活菌數、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.2 單菌種最適發酵時間的確定 取活化后的4043號菌種子液，按3%（v/v）比例接種于L-Glu-Na質量濃度2 g/L的發酵乳液中，分別于最適發酵溫度下恒溫發酵12、24、36、48、60 h，隨后測定發酵終點酸奶的酸度、活菌數、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.3 單菌種最適接種量的確定 取活化后的4043號菌種子液，分別按2%、3%、4%、5%、6%（v/v）比例接種于L-Glu-Na質量濃度2 g/L的發酵乳液中，在最適發酵溫度和發酵時間下恒溫發酵至終點，隨后測定酸奶的酸度、活菌數、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.4 單菌種最適L-Glu-Na添加量的確定 取適量L-Glu-Na加入10%（w/v）乳液，分別配制L-Glu-Na質量濃度為0、1、2、3、4、5 g/L的發酵乳液。取活化后的4043號菌種子液按5%（v/v）的比例轉接于上述發酵乳液中，最適發酵溫度和發酵時間下發酵至終點，隨后測定酸奶的酸度、活菌數、pH及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.5 雙菌種復配方案及最適發酵溫度的確定將活化后的1443號菌、1060號菌、1134號菌分別與4043號菌的種子液按1:1比例進行復配，并按6%（v/v）的總比接種于L-Glu-Na質量濃度2 g/L的發酵乳液中，分別在34和37℃下恒溫發酵48 h，隨后測定發酵終點酸奶的酸度、活菌數、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.6 雙菌種最適發酵時間的確定 將活化后的4043號菌和1443號菌種子液按1:1比例進行復配，并按6%（v/v）的總比接種于L-Glu-Na質量濃度2 g/L的發酵乳液中，分別于34℃恒溫發酵12、24、36、48、60 h，隨后測定發酵終點酸奶的酸度、活菌數、p H及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.2.7 雙菌種最適總接種量的確定 將活化后的4043號菌和1443號菌的種子液按1:1比例進行復配，并分別按4%、6%、8%、10%、12%的總比接種于L-Glu-Na質量濃度2 g/L的發酵乳液中，在34℃下恒溫發酵48 h，隨后測定發酵終點酸奶的酸度、活菌數、pH及GABA、L-Glu-Na含量。

1.2.3 均勻實驗 根據單因素實驗結果，選擇發酵時間、發酵溫度、L-Glu-Na添加量、球/桿菌配比為影響因素，并設定適宜水平，進行均勻實驗。使用DPS 7.05（Data Processing System 7.05）數據處理系統，制作一個U12（12×63）混合水平均勻設計表，在錄入因素及水平個數后，控制最大尋優時間為5 min、最大迭代次數為1000次的優化操作，最終得到的混合水平均勻設計方案（中心化偏差CD=0.1296），如表1所示。

表1 混合水平均勻設計方案Table 1 Mixed-level uniform design scheme

1.2.4 GABA和L-Glu-Na的定量檢測 使用HPLC法，在QB/T 4587-2013檢測方法基礎上加以改進。精密吸取適量樣品液與等體積的鄰苯二甲醛衍生劑混合，室溫反應2 min后經0.22μm尼龍針頭過濾器轉移至液相進樣瓶。流動相A為25 mmol/L醋酸鈉，調p H至7.2；流動相B為甲醇和乙腈，混合比例為50:50，兩相均經0.45μm有機系濾膜抽濾后超聲脫氣20 min后使用。色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱溫為40℃，流速為1 mL/min，進樣量為20μL，檢測波長334 nm，梯度洗脫（梯度洗脫程序如表2所示）。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

配制10、50、100、150、250μg/mL的GABA標準工作液并繪制標準曲線。以峰面積（y）對GABA濃度（x）做線性回歸，得線性回歸方程y=14179x?59007，線性決定系數R2=0.9998。

配制10、100、500、1000、1500 μg/mL的L-Glu-Na脫脂乳溶液并繪制標準曲線。以峰面積（y）對LGlu-Na濃度(x)做線性回歸，得線性回歸方程y=5392x+534801，線性決定系數R2=0.9989。

1.2.5 酸度和p H的測定 酸奶酸度參照國標GB 5009.239-2016《食品酸度的測定》，采用乳與乳制品酸度的測定方法。取酸奶樣品10 g于盛有20 mL蒸餾水的燒杯中，滴加適量酚酞混勻后，用0.1 mol/L的標準NaOH溶液滴定至淡粉色且30 s不褪色，即為滴定終點。記錄消耗的NaOH溶液體積（mL），計算酸度值（°T）。

酸奶pH采用pH計測定。取酸奶樣品10 g于燒杯中，按照1:1添加去離子水混勻，用PHS-3C型p H計測定稀釋后樣品的pH。

1.2.6 乳酸菌活菌數的測定 參照國標GB4789.35-2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》，采用平板計數法。取酸奶樣品25 g于盛有225 mL滅菌生理鹽水的燒杯中混勻，后取10 mL于90 mL滅菌生理鹽水試管中混勻，依次操作進行10倍稀釋后選取適合的梯度，吸取100μL的樣品勻液涂布于MRS平板培養基，在37℃下厭氧培養48 h，選取菌落數為30～300的平板計數，以lg CFU/mL表示活菌數。

1.2.7 感官評定 酸奶由10名食品專業學生作為感官鑒評員分別評分，取平均值。感官評分指標及標準參考食品安全國家標準GB 19302-2010并做適當修改，如表3所示。

表3 酸奶感官評分指標及標準Table 3 Sensory evaluation index and standards of yogurt

1.3 數據處理

每次試驗均做3次平行，數據結果以Mean±SD表示。實驗數據的差異顯著性用SPSS 22.0軟件中one-way ANOVA法檢驗，P<0.05為有顯著差異，并用GraphPad Prism 8軟件作圖。正交試驗和二次正交旋轉組合實驗使用DPS7.05軟件進行實驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 單菌種發酵單因素實驗結果

2.1.1 最適發酵溫度的確定 溫度是影響菌株生長代謝的重要因素。發酵溫度對單菌種發酵結果的影響如圖1所示。由圖1可知，酸奶中GABA產量隨發酵溫度升高呈現先升后降的趨勢。由于L-Glu-Na是乳酸菌GAD轉化合成GABA的底物，故LGlu-Na殘留量即表現為相反的先降后升。比較可見，GABA產量與活菌數兩者變化趨勢并不同步，究其原因，應與溫度對4043號菌種的生長特性及其GAD的酶學性質的影響不同有關。隨著發酵溫度升高，酸奶中活菌數顯著增長，至30℃達到最高值，表明30℃為4043號菌種的最適生長溫度。隨著溫度繼續升高，4043號菌種的生長受到抑制，導致活菌數迅速下降。而有研究顯示，乳酸菌GAD的最適反應溫度分布在30～50℃區間[5]，在40℃左右活力最高[13]。因此在30～40℃范圍內，4043號菌種的GAD活力應隨溫度升高而持續增強。當發酵溫度在30～34℃范圍，活菌數開始減少，GAD活力的增強抵消了GAD總量減少的消極影響，使L-Glu-Na的轉化效率在總體上提升，GABA產量繼續增加。但隨著溫度升高，活菌數進一步減少，使GAD總量顯著降低，即便活力進一步增強也無法提升轉化速率，導致GABA產量開始下降。4043號菌種GABA產量隨溫度升高先升后降的現象與干酪乳桿菌NFRI7415的GABA產量在37～43℃發酵溫度區間內的變化[14]類似。因此，當發酵溫度為34℃時，GABA產量即為最高值，約0.52±0.02 g/L。此外，研究顯示，L-Glu-Na在清水中的呈鮮閾值為0.30 g/L[15]，在酸奶中的呈鮮閾值約為0.13 g/L[16]。若L-Glu-Na殘留量高于0.13 g/L，則酸奶會呈現出較為明顯的咸、鮮等味道，不利于保持酸奶的良好風味，因此應盡量減少發酵終點L-Glu-Na的殘留。L-Glu-Na殘留量在34℃時為0.50±0.03 g/L，雖高于0.13 g/L，但已是最低值，且較其他發酵溫度組均具備顯著性差異（P<0.05）。故確定34℃為最適發酵溫度。

圖1 發酵溫度對單菌種發酵結果的影響Fig.1 Influenceof fermentation temperature on result offermentation with singlestrain

2.1.2 最適發酵時間的確定 對發酵時間的合理控制有助于提高效率，降低成本。由圖2可知，發酵時間為12～24 h時，GABA產量增長緩慢；進入24～48 h階段，GABA產量隨時間延長增加顯著（P<0.05）；當發酵時間進一步延長至48～60 h階段，GABA產量趨于穩定。當發酵時間為48 h時，GABA產量為0.68±0.02 g/L，已達到最大產量的95%左右。此外，活菌數表現為在12～24 h階段顯著（P<0.05）增長，在24～60 h階段持續下降（P<0.05）。結合菌株生長曲線和GABA產量曲線，可以發現GABA的生產過程可以大致分為兩個階段：12～24 h為延滯期，24～60 h為積累期。推測可能是因為：在延滯期，發酵乳液中營養豐富，菌株快速生長并大量產酸，導致酸度顯著增加（P<0.05），pH降低，形成酸性環境。在此階段，GAD活性活性增加較慢[5]。隨后酸性環境激活并誘導GAD表達[17]，L-Glu-Na脫羧反應得以順利進行，GABA開始生成并進入積累期。隨著發酵時間延長，發酵乳液內營養物質逐漸消耗殆盡，菌株個體間競爭加劇[18]，活菌數減少，導致反應速度和產物積累速度逐漸減緩。4043號菌種對應的GABA產量變化滯后于活菌數變化的現象，與植物乳桿菌WZ011（Lactobacillllus plantarumWZ011）在GYP培養基中的發酵動力學曲線（優化前后）類似[19]。當發酵時間為60 h時，雖然L-Glu-Na殘留量顯著小于48 h時的殘留量（P<0.05），但GABA產量幾乎沒有增加，加之發酵時間過長會導致酸奶乳清析出增多，影響酸奶表觀和感觀評價。綜合考慮生產成本和發酵周期，確定48 h為最適發酵時間。

圖2 發酵時間對單菌種發酵結果的影響Fig.2 Influence of fermentation timeon result of fermentation with single strain

2.1.3 最適發酵接種量的確定 接種量大小對活菌數和GAD酶總量有直接的影響。由圖3可知，當接種量從2%（v/v）增至5%（v/v）時，GABA產量隨著接種量增加而增大，至5%（v/v）時達到最高值約0.85±0.03 g/L。如接種量繼續增加，GABA產量則顯著降低（P<0.05）。究其原因，和活菌數、GAD與L-Glu-Na的相對量（濃度）變化有關。在發酵乳液中，底物即L-Glu-Na總量及濃度保持不變。當接種量處于2%～5%的范圍內，活菌數和GAD總量相對較少，底物L-Glu-Na總量相對較高。此時增大接種量能夠加快轉化效率，提升代謝產物即GABA的產量。從圖3A可以看出，該階段又可分為兩個區間：當接種量小于3.4%（v/v）時，GAD對L-Glu-Na的轉化比例低于50%，導致L-Glu-Na殘留量大于GABA產量，可稱為“次優區間”；當接種量超過3.5%（v/v）時，GAD對L-Glu-Na的轉化效率高于50%，GABA產量開始高于L-Glu-Na殘留量，可稱為“最優區間”。而當接種量超過5%（v/v）時，菌體濃度過大，無法與底物有效結合，菌株個體間競爭抑制了GAD的轉化效率[20]。這導致GABA產量下降，L-Glu-Na殘留量升高，加之發酵乳液內有限的營養物質不足以支持全體菌株生長，活菌數最終也會減少。可見，適宜的接種量更利于GABA產量積累。當接種量為5%（v/v）時，GABA產量最高，且L-Glu-Na殘留量顯著優于其余各接種量組（P<0.05）。故確定5%（v/v）為最適發酵接種量。

圖3 接種量對單菌種發酵結果的影響Fig.3 Influence of inoculation quantity on result of fermentation with singlestrain

2.1.4 最適L-Glu-Na添加量的確定L-Glu-Na添加量與GABA產量、GAD活性及酸奶口感均關系密切。由圖4可知，當L-Glu-Na添加量從0 g/L增大至4 g/L，GABA產量同步增加，至4 g/L時GABA產量達到最大值約1.03±0.03 g/L。而后隨著L-Glu-Na添加量繼續增大，GABA產量出現顯著下降（P<0.05）。推測可能與GAD活性變化有關。由圖4可知，L-Glu-Na添加量的變化對活菌數無顯著影響（P>0.05），即GAD總量基本保持不變。而L-Glu-Na作為GABA的底物，不但可以影響GABA的生成量，還可通過調節GABA代謝支路中碳流量的變化，調節GAD活性[21]。當L-Glu-Na添加量介于0～4 g/L時，底物濃度相對較低，轉化反應相當于酶促反應中一級反應或混合反應階段，加之此階段GAD活性隨L-Glu-Na濃度升高而升高[5]，GABA產量隨之顯著增加（P<0.05）。當L-Glu-Na添加量超過4 g/L時，底物濃度相對過高，將GAD飽和，轉化反應受到反饋抑制，GAD酶活降低[14]，導致GABA產量隨之下降，L-Glu-Na殘留量也因未能充分反應而迅速增加至約2.10±0.15 g/L，嚴重影響酸奶風味。綜合GABA產量和感官評價，確定最適L-Glu-Na添加量為4 g/L。

圖4 L-Glu-Na添加量對單菌種發酵結果的影響Fig.4 Influence of L-Glu-Na quantity on result of fermentation with single strain

根據課題組前期研究的結果，優化發酵條件前，將4043號菌以3%（v/v）接種于含L-Glu-Na 2 g/L的10%（w/v）脫脂復原乳中，在30℃下單菌種發酵48 h，GABA產量約為0.39±0.07 g/L。優化發酵條件后，當L-Glu-Na添加量為4 g/L、接種量為5%（v/v）時，4043號菌在34℃下于10%（w/v）的脫脂復原乳中恒溫發酵48 h，GABA產量最高可達1.03±0.03 g/L，是優化前的約2.64倍。相比之下，趙樹平等[22]從國產酸馬奶中篩選的瑞士乳桿菌ND01（Lactobacillus helveticusND01），按3%（v/v）接種于11%（w/v）的滅菌復原乳中，在37℃下單菌發酵30 h，GABA產量最高約0.17 g/L。賢乾隆等[23]從國內酸菜和酸奶中分離得到的干酪乳桿菌QL-20（Lactobacillus caseiQL-20），按3%（v/v）接種至含L-Glu-Na 1%（w/v）的12%（w/v）的脫脂乳培養基中，37℃下單菌發酵48 h后，發酵乳中GABA產量約0.29 g/L。韓嘯等[24]將從新鮮糞便中分離得到的短乳桿菌DL1-11（Lactobacillus brevisDL1-11）接種于（接種量6×107CFU/mL）蔗糖添加量5%（w/v）、L-Glu-Na添加量0.15%（w/v）的11%（w/v）的脫脂復原乳中，在35℃下單菌發酵9 h后，GABA產量最高達到101.20±2.48 mg/100 g。4043號菌在當前工藝條件下的GABA產量優于上述文獻報道的產量，但L-Glu-Na殘留量約0.69±0.09 g/L，殘留量過高，導致酸奶綜合感官評分很低。此外，課題組前期動物實驗結果表明，GABA的有效劑量應不低于300 mg/d。若產品的攝入量為200 mL/d，則產品中GABA濃度應高于1.50 g/L。

為解決上述問題，可通過多種乳酸菌的復配和混合發酵，充分發揮菌種各自的發酵性能[25]。如薛玉清等[26]將從內蒙古傳統酸奶中篩選的植物乳桿菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）按照0.5:0.5:1.5的比例、總接種量為2%（v/v）接種至滅菌乳中，在43℃恒溫混合發酵3.6 h，GABA產量超過了1.51 g/L。韓梅等[16]將光明乳業實驗室保藏的嗜酸乳桿菌gm-11（Lactobacillus acidophilusgm-11）和嗜熱鏈球菌gm-12在均質后的牛奶中混合發酵，在總接種量為1×106CFU/mL時，不同接種比例組在發酵終點的GABA產量均明顯高于兩種菌各自單菌發酵的產量，且當gm-11：gm-12為5:1時，GABA產量最高達5.62 g/L。Han等[27]將一株產GABA的嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）按1:1（接種量均為1×106CFU/mL）接種于含L-Glu-Na為15 g/L的脫脂乳液中，在37℃下混合發酵48 h后，GABA產量達到8.3 g/L，是其單菌發酵時的2.96倍。可見，復配多菌種混合發酵有助于進一步優化工藝條件，顯著提升發酵效率和GABA產量。

2.2 雙菌種混合發酵單因素實驗結果

2.2.1 雙菌種復配方案及最適發酵溫度的確定 課題組前期的研究結果表明，1060號菌、1134號菌和1443號菌均不具備GABA合成能力。將三種菌接種于發酵乳液中，在各自最適生長溫度下（1060號菌的最適生長溫度為37～45℃，1134號菌和1443號菌均為37℃[28]）恒溫發酵48 h后，酸奶的乳清析出控制均能滿足GB 19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》中的感官要求。參照前期預實驗的結果，將三種菌分別與4043號菌按照1:1復配，進行雙菌種混合發酵實驗?；?.1.1的實驗結果及三種復配菌的最適生長溫度，選擇34和37℃以研究不同發酵溫度對混合發酵GABA產量的影響，結果如表4所示。

由表4中可見，各復配組在34℃下的GABA產量和L-Glu-Na殘留量均優于37℃下的結果，且組間均存在顯著性差異（P<0.05），故確定34℃為多菌混合發酵的最適發酵溫度。在34℃下，1134號復配組和1443號復配組的GABA產量均略優于4043號菌單菌發酵時的最大產量1.03±0.03 g/L，而L-Glu-Na殘留量均遠遠小于4043號菌的0.69±0.09 g/L。推測是復配菌種間的共生作用所致[29]。如傳統酸奶的發酵劑多由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌復配而成。在混合發酵時，嗜熱鏈球菌生長性能好，產酸速率高，能夠在發酵初期迅速創造酸性環境[30]，并為德氏乳桿菌保加利亞亞種提供生長所需的葉酸[31]、甲酸[32]和CO2[33]等物質。而德氏乳桿菌保加利亞亞種的蛋白水解能力較強，能夠生成多肽和氨基酸來促進嗜熱鏈球菌的生長[34]。乳酸乳球菌乳酸亞種同樣具備較強的利用乳糖酵解乳酸的能力[35]，副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌均具備良好的耐酸能力[36?37]，復配組球菌、桿菌間具備互惠共生的基礎，同時也應該具備增強菌種活力、提升L-Glu-Na向GABA的轉化效率等效果。因1443號復配組在發酵終點的乳清析出控制優于1134號復配組，故確定1443號菌作為雙菌種混合發酵的復配菌種。

表4 菌種復配和發酵溫度的影響Table 4 Effects of strain collocation and fermentation temperature

2.2.2 最適發酵時間的確定 由圖5可知，對于雙菌種混合發酵，在12～48 h時階段，GABA產量隨發酵時間延長顯著增加（P<0.05）；隨著發酵時間進一步延長，GABA產量反而有所降低。結合2.1.2可知，發酵溫度對雙菌種混合發酵GABA產量的影響與對單菌種發酵GABA產量的影響類似。當發酵時間為48 h時，GABA產量達到最高值，約1.05±0.02 g/L；L-Glu-Na殘留量約為0.08±0.01 g/L，低于其在酸奶中的呈鮮閾值，且與其他發酵時間組間存在顯著性差異（P<0.05）。綜合考慮GABA產量與生產周期，選擇48 h為多菌混合發酵的最適發酵時間。值得注意的是，在L-Glu-Na添加量和4043號菌種接種量相同的前提下，雙菌種混合發酵的活菌數、酸奶酸度、GABA產量和產率均明顯高于單菌種發酵相同發酵時段的各對應結果，而酸奶pH和L-Glu-Na殘留量均明顯低于各對應結果。這證明了2.2.1中有關雙菌種混合發酵能夠顯著增強菌種活力、產酸能力及提升L-Glu-Na向GABA的轉化效率等推論。

圖5 發酵時間對雙菌種混合發酵結果的影響Fig.5 Influence of fermentation time on result of mixing fermentation with double strains

2.2.3 最適總接種量的確定 由圖6可知，總體而言，總接種量增大對雙菌種混合發酵的GABA產量影響不大：當總接種量由4%（v/v）增至6%（v/v）時，GABA產量有顯著增長（P<0.05）；但在6～12%（v/v）區間，GABA產量基本穩定，略有波動。值得注意的是，自初始總接種量起，雙菌種混合發酵始終處于“最優區間”內，GABA產量始終明顯高于L-Glu-Na殘留量。這表明在發酵乳液中，活菌和GAD的濃度始終低于L-Glu-Na的濃度。而GABA產量未跟隨總接種量的增大而提升，應為乳酸乳球菌乳酸亞種GAD的pH活性范圍較窄、pH依賴性較強所致[38]。雙菌種混合發酵顯著增強了菌種的產酸能力，使酸奶酸度明顯升高，pH明顯降低。當總接種量大于6%（v/v）時，酸奶pH已降至4.0以下，明顯低于GAD的最適pH4.7[39?40]，使其相對酶活低于50%[38]。此時繼續增大總接種量，雖能提升GAD總量，但會使酸奶pH和GAD相對酶活進一步降低，導致總體轉化效率和GABA產量變化不大。從生產成本的角度出發，總接種量6%（v/v）為宜。此時GABA產量約1.82±0.22 g/L，L-Glu-Na殘留量約0.52±0.15 g/L。

圖6 總接種量對雙菌種混合發酵結果的影響Fig.6 Influence of total inoculation quantity on result of mixing fermentation with double strains

2.3 均勻實驗結果

U12（12×63）混合水平均勻設計實驗的結果如表5所示。利用DPS 7.05軟件對各指標進行二次多項式逐步回歸分析，結果如表6所示。

表5 均勻實驗結果Table 5 Results of uniform experiment

表6 指標模型Table 6 Model of varies parameters

其中，各因子對GABA影響主次順序為X3（P=0.0004）> X32（P=0.0004）>X1X2（P=0.0055）> X42（P=0.0293）>X3X4（P=0.1273）>X2X4（P=0.1986）。選擇Y2即GABA產量最大值對模型方程進行最值參數優化，計算可得，當發酵時間為48.42 h、L-Glu-Na添加量為8 g/L、發酵溫度為32.23℃、球菌與桿菌配比為1:3時，發酵終點GABA理論產量約3.84 g/L。

2.4 驗證性實驗結果

根據模型方程最值參數優化結果，選擇如下發酵工藝參數進行驗證性實驗：發酵時間為48 h、發酵溫度為32℃、L-Glu-Na添加量為8 g/L、球菌與桿菌配比為1:3。進行3次平行試驗，測得發酵終點酸奶中GABA實際產量為4.10±0.10 g/L，是優化前的3.78倍。L-Glu-Na殘留量約0.11±0.01 g/L，低于其酸奶中的呈鮮閾值；活菌數為3.03×1010±1.75×1010CFU/g，酸度值為129.67±2.08°T，且酸奶各項指標均能夠滿足GB19302-2010《食品安全國家標準 發酵乳》中的相關規定，略優于模型預測值。不足是口感偏酸，綜合感官評分約78.42±4.63分，屬中上水平。該模型方程能夠較為準確地分析各因素對雙菌種混合發酵酸奶中GABA產量的影響。

3 結論

本研究利用課題組前期篩選得到的在乳基底物中具備高產GABA潛力的乳酸乳球菌乳酸亞種菌種與干酪乳桿菌復配，以脫脂復原乳液為主要原料，進行雙菌種混合發酵實驗。經單因素實驗和均勻實驗，確定最優發酵工藝參數為：發酵時間48 h、發酵溫度32℃、L-Glu-Na添加量8 g/L、乳酸乳球菌乳酸亞種與干酪乳桿菌配比1:3。最終得到酸奶中GABA產量約4.10±0.10 g/L，是優化前的3.78倍，酸奶各項指標滿足GB 19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》中的相關規定，綜合感官評分良好。該工藝簡化了流程，降低了成本，GABA生產能力突出，可應用于富含GABA功能性酸奶的生產開發中。