特納草黃酮超聲強化提取工藝的響應面法優化及其抗氧化性

譚春遠，閻 杰 ，黃惠敏，周志堅，鄔子君

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.仲愷農業工程學院化學化工學院，廣東廣州 510225）

特納草（Damiana），又稱達迷草、達米阿那，是墨西哥和中南美洲特有的一種唇形科特納草屬多年生草本植物，主要分布于巴西東北部、中美洲、加勒比海地區、墨西哥和德克薩斯州干旱和半干旱地區[1,2]。特納草在國外因壯陽作用而聞名，具有較高的經濟效益，可用于治療陽痿、痛經、激素失衡、性病、抑郁癥、痢疾、食欲不振、消化不良等，是很多重要藥品和保健品的原料[2?7]。

黃酮是特納草中重要的有效成分，Zhao等[8]和Johanna等[9]分別從特納草中分離鑒定出19種和3種黃酮成分，Piacente等[10]從墨西哥采摘的特納草中分離出6種黃酮成分。綜合分析國外文獻，已鑒定結構的特納草黃酮按母核結構主要分成五類：黃烷酮、柚皮素、芹菜素及其衍生物、木犀草素和苜蓿素衍生物、槲皮素和楊梅素衍生物[5,8?15]。黃酮可通過溶劑萃取、超臨界流體萃取、微波提取、超聲提取等方法提取[16?19]。對于特納草黃酮的提取，目前文獻報道主要采用溶劑萃取法，也有采用超聲強化法[7,9?10]。Piacente等[10]和Kumar等[7]分別用沸水和甲醇從墨西哥和印度種植的特納草中提取出黃酮。常規溶劑提取時間較長，而超聲作用能促使細胞壁、細胞膜破裂，利于有效成分溶出和擴散，提高效率，縮短時間[20,21]。Johanna等[9]以70%丙酮為溶劑，采用了超聲強化提取特納草黃酮成分，效率高，用時短。

特納草提取物具有明顯的抗氧化作用。Torres-González等[22]研究發現特納草醇-水提取物具有明顯的清除DPPH自由基作用，提取物濃度為1.0 mg/mL時，清除率達82.47%。Salazar等[23]試驗表明，特納草甲醇提取物能清除DPPH自由基，還能抑制黃嘌呤氧化酶的活性。Jonathan[24]的研究顯示特納草提取物具有明顯的抗氧化作用，且起作用的主要成分為黃酮類化合物——木犀草素。

近年來，我國云南開展了特納草的引種種植，由于時間短，尚沒有開展有效成分提取及相關性質的研究。基于此，本論文以我國引種的特納草為原料，進行超聲強化黃酮的提取，通過試驗考察超聲時間、溫度、超聲功率、料液比、乙醇體積分數等對黃酮提取率的影響，結合響應面法進行優化，并通過清除DPPH自由基、ABTS自由基及還原力試驗考察黃酮的抗氧化能力，以期為我國特納草的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特納草 云南紅河谷辣木產業有限公司；蘆丁（99%） 上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、22’-二氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基（ABTS+·） 南京都萊生物技術有限公司；過硫酸鉀、醋酸鈉 福晨（天津）化學試劑有限公司；醋酸 天津市富宇精細化工有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉 天津市永大化學試劑有限公司；氫氧化鈉、無水乙醇 天津市百世化工有限公司；自制去離子水；所有測試用試劑 均為分析純。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；UV-1800紫外可見吸收光譜儀日本島津公司；800Y高速多功能粉碎機 武義海納電器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9030A鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；BILON-1000D超聲波信號發生器 上海比朗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 特納草黃酮的提取工藝流程60℃烘至恒重→粉碎→過50目篩→加入溶劑→超聲提取→定容→過濾（濾液作為提取液）。

1.2.2 超聲提取試驗

1.2.2.1 超聲時間對黃酮提取率的影響 以60%乙醇，料液比1:60（g/mL），超聲功率240 W，超聲溫度55℃為固定條件，考察超聲時間為10、20、30、40、60 min時對特納草黃酮提取率的影響。

1.2.2.2 超聲溫度對黃酮提取率的影響 以60%乙醇，料液比1:60（g/mL），超聲功率240 W，超聲時間30 min為固定條件，考察超聲溫度為30、40、55、65、75、85℃時對特納草黃酮提取率的影響。

1.2.2.3 超聲功率對黃酮提取率的影響 以60%乙醇，料液比1:60（g/mL），超聲時間30 min，超聲溫度55℃為固定條件，考察超聲功率為0、160、240、320、400 W時對特納草黃酮提取率的影響。

1.2.2.4 料液比對黃酮提取率的影響 以60%乙醇，超聲功率240 W，超聲時間30 min，超聲溫度55℃為固定條件，考察料液比為1:20、1:40、1:60、1:80、1:100 g/mL時對特納草黃酮提取率的影響。

1.2.2.5 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響 以料液比1:60（g/mL），超聲功率240 W，超聲時間30 min，超聲溫度55℃為固定條件，考察乙醇體積分數為0%、20%、40%、60%、80%、90%、無水乙醇時對特納草黃酮提取率的影響。

1.2.3 響應面試驗設計 根據上述試驗結果，使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，以黃酮提取率為響應值，超聲時間、超聲功率、超聲溫度和乙醇體積為響應變量，設計4因素3水平的響應面分析試驗，根據結果確定特納草黃酮的最佳提取條件。試驗因素及水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Response surface test factors and level design

1.2.4 黃酮提取率的測定

1.2.4.1 標準曲線的制作 按文獻方法[25]進行操作。以蘆丁為標準品，采用氯化鋁-甲醇法測400 nm波長處的吸光度，以質量濃度對吸光度繪制標準曲線。在0.005～0.050 mg/mL濃度范圍內得回歸方程為：y=21.0589x?0.00518，R2=0.99969。

1.2.4.2 黃酮提取率的測定 準確吸取適量提取液于10 mL比色管中，搖勻得樣品液，其余操作與上述標準曲線的制作相同，測定樣品液中黃酮含量，并計算黃酮提取率。

式中，m1和m2分別表示提取液中黃酮的質量和原料（干基）中黃酮的質量（g）。

1.2.5 抗氧化性試驗

1.2.5.1 清除DPPH自由基試驗 參照陳叢瑾等[26]方法稍作修改，對1.2.1的黃酮粗提液進行濃縮，用去離子水稀釋濃縮液制成0.005、0.01、0.015、0.03、0.1 mg/mL 5個不同濃度樣品液，取0.5 mL樣品液于10 mL比色管中，加入4.5 mL 0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液充分混勻，室溫下反應30 min，于519 nm處測定吸光值A0，同時測定0.5 mL樣品液與4.5 mL無水乙醇混合后的吸光值Aj和空白樣品吸光值Ac。

1.2.5.2 清除ABTS自由基試驗 參照李培源等[27]方法稍作修改，稱取一定量ABTS溶解于20 mmol/L、pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，振蕩溶解配制成7 mmol/L的ABTS儲備液；稱取一定量的過硫酸鉀溶解于去離子水中，配制成2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，取體積比為1:1的ABTS儲備液和過硫酸鉀溶液混合搖勻，在黑暗處氧化12 h，稀釋30倍得到ABTS自由基工作液。設置5個樣品濃度，分別為0.005、0.01、0.015、0.05、0.1 mg/mL，取1 mL不同濃度的樣品液與4 mL工作液于25 mL比色管中，充分混合后在黑暗處反應30 min，在734 nm處測吸光值，記為A′0，再取1 mL樣品液與4 mL無水乙醇充分混合后測量吸光值，記為A′j， 空白樣品吸光值為A′c。

1.2.5.3 還原力試驗 參考文獻[28]，分別移取0.01、0.02、0.03、0.0785、0.157 mg/mL 5個不同濃度的樣品溶液1.5 mL于離心管中，加入0.2 moL/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）1.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液1.5 mL，將混合物于50℃水浴保溫20 min，加入1.5 mL 10%（w/v）三氯乙酸溶液，混合溶液3000 r/min離心10 min，精密吸取上清液2.00 mL，加入7.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1%的三氯化鐵溶液，在700 nm處測吸光度（吸光度值越大，還原力越強）。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次，采用Origin2017和Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對試驗數據進行作圖和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲時間對提取率的影響 由圖1可知，隨著提取時間的延長，黃酮提取率先升高后趨于穩定，體現了提取量隨時間延長的累積效應[29]，在提取時間為40 min時基本趨于平穩，可能是隨著時間的增加，粘液等物質溶出，溶液中雜質的含量增加，降低了黃酮類物質在溶劑中的擴散速度，影響黃酮的提取率[30]。選擇40 min左右比較適宜。

圖1 超聲時間對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasound time on the extraction rate of flavonoids

2.1.2 超聲溫度對提取率的影響 由圖2可知，隨超聲溫度的升高，特納草黃酮的提取率先升高后下降，在65℃時提取率達到最大，當超聲溫度超過65℃時，含量下降。從理論上講，升高超聲溫度，分子的運動速率加快，提取液黏度降低，利于黃酮的溶解與溶出，提取率增加[31]。但當超聲溫度繼續升高，溶劑揮發加劇，有效溶劑量降低，溶劑與特納草接觸面積減少，降低了擴散速率，使得提取率降低；此外，在高溫條件下，雜質更容易溶出，對后續分離不利，同時也增加了能耗[32]。綜合各因素考慮，適宜的超聲溫度為65℃。

圖2 超聲溫度對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of flavonoids

2.1.3 超聲功率對提取率的影響 由圖3可知，隨超聲功率的加大，特納草黃酮的提取率先升高后下降，在320 W時提取率達到最大。由于超聲波在溶液中傳播時，具有空化效應，能破壞細胞壁和細胞膜，使存在于細胞內的物質更容易溶出，超聲功率越大，空化越劇烈，細胞破壞越充分，黃酮越易溶出，提取率越大[33]。但超聲功率過大，會產生大量無用的氣泡，形成聲屏障，阻礙聲傳播，對提取反而不利[34]。本試驗較佳的超聲功率為320 W。

圖3 超聲功率對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of flavonoids

2.1.4 料液比對提取率的影響 由圖4可知，隨著溶劑用量的增大，黃酮的提取率大體呈上升趨勢，但料液比從1:40 g/mL增加到1:100 g/mL之間，提取率增加的幅度較小，提取率增加小于2%。隨著料液比的增加，溶劑用量大，會大幅提高提取液中溶劑回收的成本。因此，適宜的料液比為1:40 g/mL。

圖4 料液比對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the extraction rateof flavonoids

2.1.5 乙醇體積分數對提取率的影響 由圖5可知，隨著乙醇體積分數的提高，特納草黃酮提取率逐漸增大。當乙醇體積分數達到80%時，黃酮的提取率最大。超過80%時，溶劑極性降低，根據相似相溶原理，親水性強的黃酮溶出減少，反而醇溶性的雜質溶出增多，降低了黃酮的提取率[32]。所以，乙醇體積分數80%左右比較適宜。

圖5 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of flavonoids

2.2 響應面法優化提取工藝

前述試驗結果表明，料液比對特納草黃酮提取率的影響較小，為簡化試驗，減少試驗次數，選擇超聲時間、超聲功率、超聲溫度和乙醇體積為響應設計變量，設置4因素3水平響應面分析試驗共有29個試驗點，其中5個中心點，24個析因點，設計方案及結果見表2。

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert.V 8.0.6.1對表2的試驗結果進行響應面分析法分析，以黃酮提取率為響應值，對超聲時間（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）、乙醇體積分數（D）經回歸擬合后，得到的回歸方程為：

表2 試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design scheme and results

根據回歸方程方差分析及相關系數來考察模型的可靠性。由表3可知，二次回歸模型的F值為29.74，P值<0.0001，失擬項P=0.6710>0.1000，表示試驗結果和數學模型擬合良好。試驗模型的決定系數R2=0.9675，說明該回歸方程能很好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以用其確定最佳提取工藝條件，試驗結果與模型預測結果有著良好的一致性。試驗模型的校正系數Radj2=0.9349，試驗結果有93.49%受試驗因素的影響。因此，結果可靠，該數學模型可用于推測特納草黃酮提取量試驗結果。4個因素對黃酮提取量的影響順序為：超聲溫度>超聲功率>超聲時間>乙醇體積分數。一次項A、B、C、D，交互項AB、AC及二次項A2、B2、C2、D2對試驗指標有極顯著的影響（P<0.01），交互項AD、CD對試驗有顯著的影響（P<0.05），其余項不顯著。

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression equation

2.2.2 響應面交互作用分析及最優條件驗證 利用Box-Behnken分析各因素交互作用，擬合出響應面立體圖，更直觀描述各因素之間的交互作用對特納草黃酮提取率的影響，結果如圖6～圖11所示。

由圖6～圖11可知，超聲溫度對特納草黃酮提取效果的影響最為顯著。在交互項對提取率的影響中，超聲時間與超聲功率、超聲時間與超聲溫度之間交互作用明顯，表現為曲線較陡，響應值變化較大；超聲時間和乙醇體積分數、超聲溫度和乙醇體積分數之間的交互作用對響應值的影響較小，曲線較為平滑，對響應值變化較小。

圖6 超聲功率和超聲時間對特納草黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction rate of damiana flavonoids

圖11 超聲溫度和乙醇體積分數對特納草黃酮提取率的影響Fig.11 Effect of ultrasonic temperature and ethanol volume fraction on the extraction rate of damiana flavonoids

由響應面分析建立的數學模型可知，預測黃酮提取最佳工藝條件為超聲時間42.26 min、超聲溫度69.55℃、超聲功率324.8 W、乙醇體積分數81.75%，考慮實際操作方便，調整最佳工藝條件為超聲時間42 min、超聲溫度70℃、超聲功率320 W、乙醇體積分數82%，在此工藝條件下，特納草黃酮提取率為94.4%±2.37%，與模型預測值95.68%之間的標準差為0.9051，模型能較好預測特納草中黃酮提取率，優化工藝條件真實可靠。

2.3 特納草黃酮抗氧化試驗

2.3.1 清除DPPH自由基效果 黃酮類物質可以提供質子與DPPH自由基結合而形成一種穩定的抗磁性分子，降低DPPH自由基的含量[25,35]。由圖12可知，隨著黃酮提取液濃度的增加，DPPH自由基的清除率也在增加，黃酮提取液對DPPH自由基清除作用的IC50值為0.0283 mg/mL，而VC為0.0070 mg/mL。由此可知，特納草黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力弱于VC。

圖7 超聲時間和超聲溫度對特納草黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time and temperatureon the extraction rate of damiana flavonoids

圖8 超聲時間和乙醇體積分數對特納草黃酮提取率的影響Fig.8 Effect of ultrasound time and ethanol volume fraction on the extraction rate of damiana flavonoids

圖9 超聲功率和超聲溫度對特納草黃酮提取率的影響Fig.9 Effect of ultrasonic power and temperature on the extraction rate of damiana flavonoids

圖10 超聲功率和乙醇體積分數對特納草黃酮提取率的影響Fig.10 Effect of ultrasonic power and ethanol volume fraction on the extraction rate of damiana flavonoids

圖12 特納草黃酮提取液對DPPH自由基的清除效果Fig.12 Scavenging effect of damiana flavonoids extract on DPPH free radicals

2.3.2 清除ABTS自由基效果 由圖13可知，樣品液中黃酮含量與對ABTS自由基的清除能力正相關。特納草黃酮提取液對ABTS自由基清除作用的IC50值為0.0272 mg/mL，說明其對水溶性自由基有良好的清除作用；而VC的IC50值為0.0065 mg/mL，說明特納草黃酮提取物有一定的清除ABTS自由基的能力，但是效果較VC弱。

圖13 特納草黃酮提取液對ABTS自由基的清除效果Fig.13 Scavenging effect of damiana flavonoids extract on ABTSfreeradicals

2.3.3 還原力測定 特納草黃酮提取物的還原力變化如圖14所示，隨著提取液黃酮濃度的增加，吸光值呈線性增加，吸光度值越大，還原力越強。當濃度小于0.09 mg/mL時，特納草黃酮的還原力與VC基本相同，當濃度大于0.09 mg/mL時，特納草黃酮的還原力比相同濃度的VC強，濃度越大還原力差異越明顯，表明特納草黃酮具有較高的抗氧化性。

圖14 特納草黃酮提取液的還原力Fig.14 Reducing power of damiana flavonoid extract

3 結論

在單因素實驗基礎上，使用Design-Expert 8.0軟件對乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度和液料比進行中心組合實驗設計和數據擬合，得到模型的決定系數R2=0.9675，說明試驗結果與模型預測結果有著良好的一致性；各因素對黃酮提取率的影響順序為：超聲溫度>超聲功率>超聲時間>乙醇體積分數；最佳提取工藝條件為超聲時間42 min、超聲溫度70℃、超聲功率320 W、乙醇體積分數82%，在此工藝條件下，特納草黃酮提取率為94.4%。特納草黃酮的抗氧化試驗結果表明，特納草黃酮具有較強的清除DPPH自由基和ABTS自由基能力以及還原力，是良好的天然抗氧化劑。試驗表明特納草黃酮具有抗氧化作用，但本文所用原料是特納草的黃酮粗提液，雜質較多，黃酮可能不是其唯一抗氧化作用的物質，還需進一步純化、結構鑒定，用得到的純化產物進行抗氧化試驗等研究。