蒲公英多糖酶解輔助提取工藝優化及其單糖組成分析

趙 陽，劉 娜，王 園，宋 敏，王瑞芳，楊艷平，齊景偉, ，安曉萍,

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區草食家畜飼料工程技術研究中心，內蒙古呼和浩特 010018）

蒲公英（Dandelion）是一種常見的野生植物，分布廣泛、品種繁多。其具有非常豐富的活性成分，如多糖、多酚、黃酮、三萜等[1]，其豐富的活性成分給蒲公英帶來了廣泛的生物活性，包括抗氧化[2]、降血糖[3]、抗炎[4]、抑菌[5]、保肝利膽[6]、抗腫瘤[7]、免疫調節[8]、調節胃腸道微生態[9]等。近幾年來，從蒲公英中分離各種活性成分并對其結構、生物作用和生產應用的研究引起了廣大科研工作者的關注。蒲公英多糖含有葡萄糖及多種D型糖，例如甘露糖、半乳糖、木糖、鼠李糖等單糖[10]，在生物體的生長發育中起著重要作用[11]。蒲公英多糖具有很好的抗氧化活性，可以保護撲熱息痛誘導的小鼠肝臟氧化損傷[12]，對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基也具有很好的清除作用[13]；其在抗炎、抑菌方面也有很顯著的效果，可以抑制大鼠MAPK/ERK通路以減輕幽門螺桿菌相關性胃炎，保護胃黏膜[14]；且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長具有一定的抑制作用[15]。體外試驗證明，蒲公英多糖還具有一定的免疫調節作用，可以抑制小鼠單核巨噬細胞NO的分泌，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA的表達[16?17]；改善小鼠脾臟指數、脾臟生發中心反應和體內T細胞的活化，增強小鼠免疫能力[18]。

生物酶解技術的優勢在于通過酶的催化作用讓物質自體分解，與發酵相比，酶解時間比較短，作用比較直接。而固態酶解相比于液態具有廢水排放少、處理費用低、清潔環保和低能耗等特點[19]。韋婷等[20]在紅陽獼猴桃果漿中添加果膠酶，發現出汁率、感官得分率、自然澄清度都有所提高，同時總酸含量得到降低；杜靜[21]使用固態酶解處理馬鈴薯，發現添加果膠酶和纖維素酶可以顯著降低馬鈴薯渣持水力，破壞馬鈴薯渣緊密的微觀結構。現階段，大多數研究者只是通過物理壓縮與化學處理的手段破壞植物細胞壁，促進活性成分釋放，而將固態酶解技術作用于蒲公英上并探究其活性成分的研究未見報道。基于此，本試驗采用固態酶解技術處理蒲公英，通過單因素結合Box-Behnken響應面法分析了酶解工藝對蒲公英多糖含量的影響，對比研究了酶解前后蒲公英粗多糖的單糖組成和掃描電鏡，并初步解析了影響機制，為深度開發利用蒲公英資源提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲公英、小麥麩皮 原料市場；纖維素酶、β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶 夏盛實業集團有限公司；Bradford試劑 索萊寶試劑公司；苯酚、濃硫酸 天津市匯杭化工科技有限公司，均為分析純。

TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀儀器開發有限公司；Epoch2酶標儀（微孔板分光光度計）美國伯騰儀器有限公司；CP224C電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；數顯電子恒溫水浴鍋 上海醫療器械有限公司；JSM-6390LV 掃描電鏡JEOL公司；IB3型離子鍍金儀 噴金鍍膜Eiko公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗設計

1.2.1.1 麩皮對酶解蒲公英產物多糖含量的影響將蒲公英粉碎過20目篩，麩皮粉碎過60目篩，之后稱取20 g蒲公英以及20 g混有10%麩皮的蒲公英，分別加入1000 U/g果膠酶，按含水量50%、酶解溫度50℃、酶解時間4 h條件進行酶解，酶解產物烘干并粉碎，測定多糖含量。

1.2.1.2 不同酶種類對酶解蒲公英產物多糖含量的影響 取20 g混有10%麩皮的蒲公英，分別加入1000 U/gβ-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶、纖維素酶，按含水量50%、酶解溫度50℃、酶解時間4 h條件進行酶解，酶解產物烘干并粉碎，測定多糖含量。

1.2.1.3 含水量對酶解蒲公英產物多糖含量的影響 稱取20 g混有10%麩皮的蒲公英，加入1000 U/g果膠酶，酶解底物中的含水量分別為總體系的40%、45%、50%、55%，按酶解溫度50℃、酶解時間4 h條件進行酶解，酶解產物烘干并粉碎，測定多糖含量。

1.2.1.4 酶添加量對酶解蒲公英產物多糖含量的影響 稱取20 g混有10%麩皮的蒲公英，分別加入500、1000、1500、2000 U/g果膠酶，按含水量50%、酶解溫度50℃、酶解時間4 h條件進行酶解，酶解產物烘干并粉碎，測定多糖含量。

1.2.1.5 酶解溫度對酶解蒲公英產物多糖含量的影響 稱取20 g混有10%麩皮的蒲公英，加入1500 U/g果膠酶，按照酶解溫度45、50、55、60、65、70℃，含水量50%，酶解時間4 h條件進行酶解，酶解產物烘干并粉碎，測定多糖含量。

1.2.1.6 酶解時間對酶解蒲公英產物多糖含量的影響 稱取20 g混有10%麩皮的蒲公英，加入1500 U/g果膠酶，按照酶解時間0、4、8、12、16、20、24 h，含水量50%、酶解溫度60℃條件進行酶解，酶解產物烘干并粉碎，測定多糖含量。

1.2.2 Box-Behnken響應面法優化設計 通過單因素實驗結果，以多糖含量（Y）為響應值，選取A：酶解時間（h）；B：酶解溫度（℃）；C：酶添加量（U/g）；D：含水量（%）為考察的自變量，通過Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken方法設計優化實驗。以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，因子編碼及水平見表1。

表1 響應面分析試驗因素與水平Table1 Factorsand levelsused in response surfaceanalysis

1.2.3 多糖的提取方法 本試驗采用熱水浸提法提取蒲公英多糖，準確稱取1 g粉碎后的蒲公英樣品，加入16 mL蒸餾水，于80℃水浴鍋中浸提35 min，取出后流水冷卻，5000 r/min離心10 min，棄沉淀，留上清液待測。

1.2.4 多糖含量的測定 采用張倩茹[22]的方法并稍作改進，以葡萄糖為標準品，采用苯酚硫酸法測定多糖含量，具體測定步驟如下：

取1 mL稀釋適宜倍數后的蒲公英水提上清液，加入1 mL蒸餾水，再加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸混勻，室溫冷卻20 min，490 nm下測定吸光度值。根據標準曲線計算多糖含量，標準曲線回歸方程為y=0.2549x?0.0341，y代表糖的濃度（mg/mL），x代表吸光度值，R2=0.9985。

蒲公英多糖含量計算公式：

蒲公英多糖含量（mg/g）=稀釋液多糖濃度（mg/mL）×稀釋倍數×上清液體積（mL）÷稱取的蒲公英質量（g）

1.2.5 蒲公英粗多糖的制備 稱取未酶解（不添加果膠酶，其余處理與酶解樣品一致）以及酶解的樣品，以1:16的料水比在80℃水浴鍋中浸提35 min，5000 r/min離心10 min，取上清液通過旋轉蒸發儀進行濃縮，60℃烘干。加入蒸餾水配制成40 g/L濃度的溶液，加入總體積0.2%的中性蛋白酶，置于40℃水浴鍋中1.5 h，之后沸水浴10 min使酶失活。冷卻后5000 r/min離心10 min。取上清液與配好的Sevage試劑（三氯甲烷:正丁醇=4:1）按照3:1的比例避光混合，之后使用磁力攪拌器充分攪拌30 min，5000 r/min離心15 min，取上清液與配好的Sevage試劑再按照3:1的比例避光混合，重復上述操作兩次，以去除溶液中殘留的蛋白質。隨后將三次去蛋白后的溶液放入旋轉蒸發儀中濃縮，加入4倍體積的乙醇4℃沉淀12 h，5000 r/min離心10 min，棄上清，留沉淀，冷凍干燥48 h后得到蒲公英粗多糖。

1.2.6 單糖組成分析 采用劉玉輝的方法[23]，使用高效液相色譜（HPLC）對未酶解和酶解蒲公英粗多糖進行分析。HPLC條件：SHISEIDO C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相A為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）；流動相B為乙腈水溶液（82:18，v/v）；流速為1.0 mL/min；柱溫25℃；進樣量10μL；采用VWD檢測器在245 nm處檢測。

1.2.7 掃描電鏡分析 將未酶解和酶解蒲公英粗多糖用IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜，使用JSM-6390LV掃描電鏡直接進行觀察[24]。

1.3 數據統計與分析

所有試驗數據使用SAS 9.2軟件進行處理，結果均用平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 添加麩皮對蒲公英多糖含量的影響 由圖1可知，蒲公英的多糖含量為102.14 mg/g，添加10%麩皮的蒲公英多糖含量為122.53 mg/g。蒲公英、含10%麩皮的蒲公英經過果膠酶酶解4 h后，其多糖含量均顯著提高（P<0.05），分別達到137.51和170.77 mg/g，較酶解前提高了32.67%和39.37%，在底物中添加麩皮可以顯著提高酶解蒲公英多糖含量（P<0.05）。對于小麥麩皮酶解起作用更多的是纖維素酶、α-淀粉酶和木聚糖酶[25?27]，而果膠酶更多是協同分解果膠為半乳糖醛酸等小分子，破壞中草藥植物細胞壁，分解細胞壁上的多糖基質，釋放活性成分[28]，對小麥麩皮很難達到細胞壁降解的作用。麩皮的纖維結構較蒲公英更疏松多孔[29]，而纖維素類物質不同的多尺度多孔結構會影響水分在其內部分布及流動性，進而影響酶解效率；麩皮作為輔料可以起到支撐底物、提供空間和透氣性的作用，提升酶解效率，促進多糖物質釋放。因此，本研究采用90%蒲公英+10%麩皮作為酶解底物進行后續試驗。

圖1 添加麩皮對蒲公英中多糖含量的影響Fig.1 Effect of adding bran on the content of polysaccharide in dandelion

2.1.2 酶種類對蒲公英多糖含量的影響 不同種類的酶對含10%麩皮蒲公英酶解產物中多糖含量影響的結果見圖2。由圖可知，果膠酶酶解蒲公英產物中多糖含量最高，達到174.59 mg/g，顯著高于β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶（P<0.05）。蒲公英中的活性成分大部分都在細胞壁中，而果膠酶能分解植物細胞壁上的多糖基質以及果膠等大分子物質，增加有效物質的溶解，促進活性成分的釋放[28,30]，故選用果膠酶進行后續試驗。

圖2 酶種類對蒲公英中多糖含量的影響Fig.2 Effect of enzyme specieson polysaccharide content of dandelion

2.1.3 含水量對蒲公英多糖含量的影響 由圖3可知，當含水量為50%時得到的多糖含量最高，達到183.49 mg/g，且顯著高于其他組（P<0.05）。含水量體現了酶解總體系中液體量與總體系的比值，水分的流動性能夠更好的傳遞酶的作用[31]，促進酶解效率。因此，本試驗選擇含水量為50%進行后續試驗。

圖3 含水量對蒲公英中多糖含量的影響Fig.3 Effect of water content on polysaccharide content of dandelion

2.1.4 酶添加量對蒲公英多糖含量的影響 由圖4可知，在添加1500 U/g果膠酶時，其多糖含量顯著高于500、1000 U/g組（P<0.05），但與2000 U/g組差異不顯著（P>0.05）。這可能是因為酶添加量過低時，酶對底物的作用效果不足，不能完全酶解底物[31]；但添加過多時，體系中的底物已被完全酶解，部分酶沒有發揮酶解作用，造成資源浪費。為了節約生產成本，故選擇添加1500 U/g果膠酶進行后續試驗。

圖4 酶添加量對蒲公英中多糖含量的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on polysaccharide content of dandelion

2.1.5 酶解溫度對蒲公英多糖含量的影響 由圖5可知，隨著溫度的升高，酶解蒲公英多糖含量呈現先升高后下降的趨勢，60℃時達到202.54 mg/g，顯著高于除55℃以外的其它溫度組（P<0.05）。這可能是因為溫度會影響果膠酶的活性，溫度過高或過低都不利于果膠酶發揮作用[32]。因此，本試驗選擇酶解溫度為60℃進行后續試驗。

圖5 酶解溫度對蒲公英中多糖含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharide content of dandelion

2.1.6 酶解時間對蒲公英多糖含量的影響 由圖6可知，隨著時間的增加，酶解蒲公英多糖含量呈現先升高后下降的趨勢，在12 h時多糖含量達到201.16 mg/g，顯著高于除16 h以外的其它組（P<0.05）。這可能是因為在酶解剛開始時，果膠酶吸附在底物表面，發揮催化作用；隨著時間增加，酶與底物已完全反應，多糖含量會逐漸趨于穩定；但時間過長，酶活力發生下降，且部分多糖發生水解，故多糖含量會呈下降趨勢[33?34]。因此，本試驗選擇酶解時間為12 h進行后續試驗。

圖6 酶解時間對蒲公英中多糖含量的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on polysaccharide content of dandelion

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面結果 響應面優化試驗設計及結果見表2，對表2的數據進行擬合分析，通過模型分析得到回歸方程：Y=216.66+3.89A?6.11B+1.81C+6.57D+2.57AB?2.77AC+0.68AD?3.76BC?12.29BD?0.99CD?18.48A2?18.26B2?16.62C2?2.26D2，對模型進行方差分析，所得結果見表3。

表2 Box-Behnken響應面優化試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken

從回歸模型方差分析結果（表3）可知，P=0.0041<0.01，F=4.48，表示該模型差異極顯著，即回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其應變量與全體自變量之間的線性關系是顯著的，即這種試驗方法是可靠的；失擬項用來表示所用模型與試驗擬合的程度，P=0.6175>0.05，表明失擬項差異不顯著[35]。一次項D、交互項BD對響應值多糖含量影響達到顯著水平（P<0.05）；二次項A2、B2、C2對響應值多糖含量影響達到極顯著水平（P<0.01）。根據F值A=1.73、B=4.28、C=0.37、D=4.94可知，影響多糖含量的主效應關系為：含水量>酶解溫度>酶解時間>酶添加量。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysisof variance for the fitted regression model

2.2.2 響應面分析 酶解時間、酶解溫度、酶添加量、含水量的兩兩交互作用圖如下：由圖7分析可知，在試驗范圍內，蒲公英多糖含量隨著酶解時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，酶解溫度對多糖含量的變化也有相似趨勢。從圖7的等高線可看出酶解時間和酶解溫度對蒲公英多糖含量交互作用不顯著（P>0.05）。圖8分析可知，在試驗范圍內，蒲公英多糖含量隨著酶解時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，酶添加量對多糖含量的變化也有相似趨勢。從圖8的等高線可看出酶解時間和酶添加量對蒲公英多糖含量交互作用不顯著（P>0.05）。圖9分析可知，在試驗范圍內，蒲公英多糖含量隨著酶解時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，含水量對多糖含量的變化呈上升趨勢。從圖9的等高線可看出酶解時間和含水量對蒲公英多糖含量交互作用不顯著（P>0.05）。圖10分析可知，在試驗范圍內，蒲公英多糖含量隨著酶解溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢，酶添加量對多糖含量的變化也有相似趨勢。從圖10的高等線可看出酶解溫度和酶添加量對蒲公英多糖含量交互作用不顯著（P>0.05）。圖11分析可知，在試驗范圍內，蒲公英多糖含量隨著酶解溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢，含水量對多糖含量的變化呈上升趨勢。從圖11的等高線可看出酶解溫度和含水量對蒲公英多糖含量交互作用顯著（P<0.05）。圖12分析可知，在試驗范圍內，蒲公英多糖含量隨著酶添加量的增加呈現先上升后下降的趨勢，含水量對多糖含量的變化呈上升趨勢。從圖12的等高線可看出酶解溫度和含水量對蒲公英多糖含量交互作用不顯著（P>0.05）。

圖7 酶解時間和酶解溫度對蒲公英多糖含量影響的交互作用Fig.7 Interaction of enzymolysis time and enzymolysis temperature on polysaccharidecontent of dandelion

圖8 酶解時間和酶添加量對蒲公英多糖含量影響的交互作用Fig.8 Interaction of enzymolysis time and enzyme addition amount on polysaccharide content of dandelion

圖9 酶解時間和含水量對蒲公英多糖含量影響的交互作用Fig.9 Interaction of enzymolysis time and water content on polysaccharide content of dandelion

圖10 酶解溫度和酶添加量對蒲公英多糖含量影響的交互作用Fig.10 Interaction effectsof enzymolysis temperatureand enzymeaddition amount on polysaccharidecontent of dandelion

圖11 酶解溫度和含水量對蒲公英多糖含量影響的交互作用Fig.11 Interaction of enzymolysistemperature and water content on polysaccharide content of dandelion

圖12 酶添加量和含水量對蒲公英多糖含量影響的交互作用Fig.12 Interaction of enzyme addition and water content on polysaccharidecontent of dandelion

2.2.3 最佳工藝的驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6，經過模型預測，得到最佳工藝參數為：酶解時間12.3 h、酶解溫度57.6℃、酶添加量 1532 U/g、含水量55%，該條件下多糖含量理論值為225.84 mg/g。為驗證模型準確性，用最佳工藝參數進行驗證試驗，該條件下的多糖含量實際值為218.21 mg/g，與理論值僅差0.76%，且差異不顯著（P=0.5383），表明該模型優化工藝參數可靠。

2.3 單糖組成分析

由表4可知，酶解前蒲公英多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為1.72:1.80:20.24:14.59:4.58:10.07；酶解后蒲公英多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成，其摩爾比為2.99:10.65:18:14.82:8.61:9.20:0.83。與酶解前相比，甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖含量分別增加了0.74%、490.54%、1.56%、87.79%，同時產生了巖藻糖，但葡萄糖、阿拉伯糖分別下降了11.05%、8.66%。郭慧靜[13]研究發現純化后的蒲公英多糖主要由葡萄糖和甘露糖組成，其摩爾百分比為甘露糖:葡萄糖=45.41:52.39；肖潮勇[36]分離純化出兩種蒲公英多糖，摩爾比分別為甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖=6.52:3.26:3.75:1.00:6.38以及7.90:5.10:1.00:11.55:6.61；高金波等[37]使用水提法、超聲提取法、酶提取法、超聲波協同酶法提取蒲公英粗多糖，發現其中都含有D-鼠李糖、葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖五種中性單糖，其中水提法單糖摩爾比為鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=0.088:0.500:0.190:0.340。酶解后單糖組成發生變化的原因可能是果膠酶催化降解了多糖，酶修飾因其特異性高、效率高、副作用少的優點可以使多糖得到生物改性的效果，通常改性后的多糖由于理化性質的改變，可以表現出更好的生物學特性[38]。

表4 未酶解和酶解蒲公英粗多糖的單糖組成Table 4 Monosaccharide composition of unenzymolysis and enzymolysisdandelion crude polysaccharides

2.4 掃描電鏡結果

本研究利用掃描電鏡觀察經過酶解處理后的蒲公英微觀結構變化。如圖13所示，蒲公英（圖A）表面光滑，結構緊密，沒有孔洞損傷；而經過酶解處理后的蒲公英（圖B），表面粗糙并出現較多孔洞，結構變得疏松，表面積變大。結果表明，酶解可以改變蒲公英多糖的形貌結構，其影響原因還有待深一步探討。

圖13 未酶解和酶解蒲公英粗多糖的掃描電鏡圖Fig.13 Scanning electron micrographsof unenzymolysisand enzymolysisdandelion crude polysaccharides

3 結論

以酶解蒲公英多糖含量為評價指標，通過單因素試驗及Box-Behnken響應面法優化酶解條件，最終確定蒲公英最佳的酶解工藝為：果膠酶酶解蒲公英，輔料麩皮添加量為10%，酶解時間為12.3 h，酶解溫度為57.6℃，酶添加量為1532 U/g，含水量為55%，該條件下的蒲公英多糖產量最高，為218.21 mg/g，較酶解前122.53 mg/g提高了78.09%。酶解改變了蒲公英多糖的單糖組成，提高了甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖的含量，產生了巖藻糖，但降低了葡萄糖和阿拉伯糖的含量；且酶解后蒲公英變得表面粗糙，孔洞增多，結構疏松，但其原因還有待進一步探討。本試驗研究結果將為深度開發利用蒲公英資源提供一定的理論依據。