基于遺傳算法-神經網絡的豆渣酶解工藝優化及其動力學研究

謝春平，趙良忠, ，李 明，周曉潔，黃展銳，莫 鑫，車麗娜，庾 坤

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南邵陽 422000；3.湖南省果蔬清潔加工工程技術研究中心，湖南邵陽 422000；4.廣州佳明食品科技有限公司，廣東廣州 511458）

豆渣是大豆制品加工過程中的主要副產物，其營養成分豐富[1?2]，其中被譽為“第七大營養素”的膳食纖維約占豆渣干物質的60%[3?5]。但由于口感粗糙、水分含量極高（達85%），不易儲藏，有效利用率低，大部分豆渣被直接丟棄，不僅浪費資源，還污染環境[6]。據中國豆制品行業協會數據統計，2019年用于豆制品加工的大豆約為800萬噸，以加工1噸大豆產生1.5噸濕豆渣計，豆制品加工年產濕豆渣量在1200萬噸以上[7?9]。巨量的豆渣如何進行利用，提高其附加值，是值得研究的課題之一。

研究表明，利用酶可提取豆渣中的可溶性膳食纖維（SDF）[10]、不溶性膳食纖維（IDF）[11]、多糖[12]、大豆多肽[13]等。目前酶水解豆渣的研究主要是不完全水解產物（SDF、多糖等）的工藝優化及應用，而植物纖維酶解動力學也是傾向于玉米芯[14]、燕麥殼[15]、小麥秸稈[16]等，關于豆渣酶解生成還原糖的工藝及其酶解動力學的研究鮮為報道。常見優化方法有正交試驗設計[17]、響應面優化設計（RSM）[18?19]、人工神經網絡（ANN）[20]等，幾種方法各有優劣但未見討論不同優化方法對豆渣酶解效果的影響。

因此，本文主要研究在豆渣酶解過程中p H、纖維素酶添加量、酶解溫度和酶解時間對還原糖生成量的影響，通過RSM與GA-ANN兩種方法優化出豆渣酶解生成還原糖的最佳工藝。并且在豆渣酶解優化工藝的基礎上，進一步研究豆渣的酶解動力學，以期為豆渣高效利用和后期全豆豆腐產品研究提供技術理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆渣 熟漿工藝生產豆漿所得的副產物，豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室提供；FDY-2243型纖維素酶 酶活11000 U/mL，夏盛實業集團有限公司。

MZJJ-1型熟漿生產設備 北京康得利智能制造有限公司；QDSJ9000-2型濕法超細精磨機 無錫輕大食品裝備有限公司；Atomo3.0型均質機BERTOLI；UV-1780型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 采用機械粉碎的方法處理豆渣。選取新鮮的豆渣（水分含量為79.3%），添加3倍豆渣質量的水進行濕法粉碎，再將粗粉碎后的豆渣液進行均質，均質壓力為35 MPa，物料經均質后，待用。

1.2.2 單因素實驗 以預處理豆渣液100 g為基準，分別以p H、纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間四個因素進行單因素實驗，以還原糖生成量作為評價指標，探究各因素的較優水平。固定p H為5.4、纖維素酶添加量為4%、酶解溫度為55℃、酶解時間為2 h，實驗水平設定pH為4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0；纖維素酶添加量為1%、2%、3%、4%、5%、6%（以豆渣液干物質的量計算）；酶解溫度為40、45、50、55、60、65℃；酶解時間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗基礎上，選取各因素較優水平，以還原糖生成量為響應值，根據Box-Benhnken設計原理，進行4因素3水平響應面優化試驗。試驗設計如表1所示。

表1 響應面試驗設計Table 1 Response surface experimental design

1.2.4 人工神經網絡（ANN）模型構建 本研究采用3層的ANN模型創構建實驗的優化模型，三層網絡的結構分別由輸入層、隱含層和輸出層構成[11,21]。將p H、纖維素酶添加量、酶解溫度和酶解時間設定為輸入層神經元，還原糖生成量設定為輸出層神經元，以“traingdm”為訓練函數，29組RSM數據為實際樣本，各變量增加±Δi（Δi=0.2%），采用正交L8（27），生成232個虛擬樣本，結合29組實際樣本，共261組樣本作為訓練樣本，從上至下的230組數據的60%用于訓練、20%用于檢驗、20%用于測試[22]。其中隱含層神經元數目使用經驗公式（1）計算得到，其中m為隱含層神經元個數，n為輸入層神經元個數，l為輸出層神經元個數，a為[1,10]的常數。

1.2.5 遺傳算法（GA）優化最佳工藝參數 將遺傳算法與ANN構建的模型結合，進行全面仿真實驗，以尋求豆渣酶解工藝的最佳工藝參數組合及最大的還原糖生成量的值。設定種群大小為50，最大遺傳代數150，代溝0.9，交叉概率為0.5，變異概率為0.05，運行matlab軟件程序，得到每代種群適應度及其變化結果。

1.2.6 酶解動力學 假設酶解反應速率與時間呈一種冪函數關系，同時將纖維素酶水解看成擬態一級反應,則酶解動力學可以表示為[23?25]：

其中酶解速率常數為：

式中：S0為初始濃度，g/kg；t為酶解時間；K0為與時間無關的常數；h為分形維數，描述底物顆粒不規則程度的參數；0.9為木質纖維素轉變為還原糖的系數。

1.3 還原糖含量測定及生成量計算

按照3,5-二硝基水楊酸法測定[26]。在6支試管中分別加入1 mg/mL葡萄糖標準溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，補蒸餾水至0.5 mL，然后加入DNS試劑1.5 mL，充分混勻。置沸水浴中煮沸5 min，然后迅速流水冷卻，并分別向試管中加入4 mL蒸餾水，混勻。在540 nm處讀OD值。以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標，以OD值為縱坐標制作標準曲線，得到其線性回歸方程。吸取0.5 mL樣品液，按照上述步驟操作測定OD值，并代入回歸方程中計算樣品中的還原糖含量。

式中：M0為豆渣中初始還原糖濃度，g/kg；M1為酶解反應完成后豆渣中的還原糖濃度，g/kg。

1.4 數據處理

采用Design Expert V 8.0.6、IBM SPSS Statistics22.0、Excel 2017、Origin 2018進行試驗設計和數據分析，Matlab 2016a軟件實現神經網絡和遺傳算法。且每組實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

以葡萄糖濃度（x）為橫坐標，吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，線性擬合方程為y=0.551x?0.0027（R2=0.9983）（圖1）。結果顯示葡萄糖標準溶液0～0.5 mg/mL內與吸光度的線性關系較好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素實驗結果

由圖2A知，當豆渣液p H為4.5～5.1時，豆渣酶解效果隨溶液p H的增大而增強；pH為5.1時，豆渣酶解效果最佳；當pH為5.1～6.0時，豆渣酶解效果逐漸減弱。p H會影響酶分子上酸性和堿性氨基酸殘基的側鏈基團和底物的解離狀態，進而影響酶與底物的結合[27?28]。

圖2 單因素實驗結果Fig.2 Single-factor experimental results

纖維素酶使豆渣中的不溶性膳食纖維分子鏈被切斷，分子量降低，一部分不溶性膳食纖維變成水溶性膳食纖維，然后被水解成還原糖。由圖2B知，隨著纖維素酶添加量的增加，酶與底物的接觸機率增大，從而加速了反應進程[29]；纖維素酶添加量達到4%后，還原糖生成量的增加趨勢趨于平緩，無顯著差異（P>0.05）。這可能是因為隨著酶解產物的增加，產物與酶結合，阻礙了底物與酶的結合，減緩了酶解反應進程[30?31]。出于實驗成本考慮，選擇纖維素酶添加量4%為最適添加量。

由圖2C知，隨著酶解溫度的升高，豆渣酶解效果逐漸加強，當酶解溫度達到50℃時，酶解效果達到最佳，繼續升高酶解溫度，酶解效果顯著減弱（P<0.05）。這是因為酶在低于最適溫度時，升溫會使反應體系內的物質運動加快，提高底物與酶的接觸幾率，但在最適溫度后，維持酶分子結構的次級鍵就會隨著溫度的升高開始斷裂，酶反應速率降低[32]。

由圖2D知，當酶解時間1.0～3.0 h時，還原糖生成量隨著酶解時間的延長而明顯增多，酶解時間在達到3 h以后，還原糖生成量變化不顯著（P>0.05），可能是因為隨著酶解時間的延長，酶作用越充分，豆渣濃度降低、部分酶逐漸失活以及酶解產物的反饋抑制作用增強，從而影響酶解反應的進行[33]。因而選擇酶解時間3 h為最適反應時間。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面結果 響應面實驗結果見表2。以還原糖生成量為響應值，利用Design Expert V 8.0.6統計軟件對試驗結果進行多元回歸擬合，得到關于還原糖生成量與各個因素的回歸方程的預測模型：Y=+2.42?0.4A+0.20B+0.1C+0.049D?0.045AB+0.068AC?0.045AD?0.14BC?0.007BD?0.035CD?0.18A2?0.21B2?0.14C2?0.23D2

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of the response surface experiment

2.3.2 方差分析 以還原糖生成量為響應值進行方差分析，結果見表3。顯著性檢驗結果顯示，還原糖生成量回歸模型差異極顯著P<0.0001，失擬值0.3641（P>0.05），表現為不顯著，說明試驗值和預測值的誤差較小。決定系數R2=0.9580，因變量和自變量之間的線性關系顯著，回歸方程擬合度較高。模型的校正決定系數R2Adj=0.9161，表明有8.39%的情況不能對該模型進行解釋。在對還原糖生成量的影響上，A、B、C、A2、B2、C2和D2均達到極顯著水平（P<0.01），BC達到顯著水平（P<0.05），其中D、AB、AC、AD、BD和CD均為不顯著因素（P>0.05）。由F檢驗可以看出A、B、C、D四個因素對還原糖生成量的影響為A>B>C>D，即p H>纖維素酶添加量>酶解溫度>酶解時間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

2.3.3 交互作用分析 響應曲面越陡峭，表明該因素對響應值的影響越大[34]，等高線的形狀反映兩因素之間交互作用的顯著程度[35?36]]。由交互作用可知，纖維素酶添加量（B）與酶解溫度（C）對還原糖生成量的影響顯著（P<0.05，見圖3），p H（A）與纖維素酶添加量（B）、p H（A）與酶解溫度（C）、pH（A）與酶解時間（D）、纖維素酶添加量（B）與酶解時間（D）、酶解溫度（C）與酶解時間（D）的交互項對還原糖生成量的影響均不顯著（P>0.05），這與方差分析結果一致。

圖3 各因素交互作用對還原糖生成量的響應曲面Fig.3 Response surfaceof the interaction of variousfactorsto the reduction of sugar production

2.3.4 RSM最佳實驗結果及驗證實驗 豆渣酶解工藝經Design Expert.V 8.0.6軟件分析得出最佳參數為：p H4.83、纖維素酶添加量為4.33%、酶解溫度為51.60℃和酶解時間3.09 h，在此條件下還原糖生成量為2.68 g/kg。根據生產實際調整確定最佳工藝參數為pH4.8、纖維素酶添加量4.3%、酶解溫度52℃、酶解時間3.1 h，在此條件下進行豆渣酶解工藝優化的驗證實驗（n=3），得到RSM實際還原糖生成量為2.54 g/kg。

2.4 ANN模型的建立與訓練

由公式（1）與其實際意義得隱含層神經元個數取值范圍為[3,13]，設定ANN訓練學習次數10000次，學習速率為0.35，動量常數為0.54，訓練步長100，直至目標誤差達到0.00001時訓練結束，尋找到測試集MSE的最小值，得到隱含層神經元個數為9。

人工神經網絡訓練出的模型，其擬合回歸系數R值表示目標數據和輸出結果的相關程度。由圖4可知，訓練、驗證、測試、與全數據圖中r值分別為0.99451、0.99413、0.99374、0.99432，在現有設置的參數下，模型擬合結果具備優良的隨機驗證效果。r預測>0.90，說明神經網絡模型不存在欠擬合狀態；因此，可認為該模型具有較強的解釋能力和較低的仿真誤差，能較好地訓練、預測和整體擬合效果。

圖4 訓練模型適配Fig.4 Training model fit

2.5 GA尋優及驗證豆渣酶解工藝結果

通過ANN模型調試函數的適應度，以還原糖生成量作為其函數的輸出值，將ANN與GA結合對酶解工藝進行尋優，獲取最佳的豆渣酶解工藝。

由圖5可得，當進化代數增大至46代時，GA停止選擇并得出適應度值最高的個體。運行出的優化結果：最優工藝參數為pH5.22、纖維素酶添加量4.38%、酶解溫度51.91℃、酶解時間3.19 h，還原糖生成量預測最大值為2.67 g/kg。考慮實際操作，將工藝修改為p H5.2、纖維素酶添加量4.4%、酶解溫度52℃、酶解時間3.2 h，在此條件下進行驗證實驗（n=3），得還原糖生成量值為2.65 g/kg。

圖5 適應度曲線Fig.5 Adaptability curve

2.6 RSM和GA-ANN預測結果對比

RSM和GA-ANN模型預測的還原糖生成量見表4。使用Excel對實測值與預測值作圖（見圖6），分別計算RSM和GA-ANN的決定系數R2、RSS與RMSE[37?39]]，為0.9583、0.1434、0.0703和0.9825、0.0353、0.0349，R2、RSS越高，RMSE越小，模型越穩健、預測效果越好；由表4可知，GA-ANN優化結果比RSM優化結果高，表明使用GA-ANN優化豆渣酶解工藝是可行的，GA-ANN模型比RSM的擬合度高、估計預測能力也相對精準。

圖6 模型預測值與實際值對比Fig.6 Compared of model predicted value and actual value

表4 RSM與GA-ANN優化結果比較Table 4 Comparison of RSM with GA-ANN optimization results

2.7 豆渣酶解動力學

用類分形動力學方程式對豆渣酶解實驗數據進行一元回歸擬合，得擬合曲線如圖7和動力學參數k0為0.5372、分形維數h為0.1530，實驗數據與方程擬合度達到0.9827，擬合效果良好。酶解速率常數反應過程的快慢，根據所得動力學參數k0與分形維數h，可得酶解速率常數隨時間變化的曲線，見圖8，由于酶的活性、底物與生成物含量變化等因素影響，酶解反應速率隨著酶解時間的增加而不斷降低。

圖7 酶解動力學曲線Fig.7 Enzymatic dynamicscurve

圖8 酶解速率常數曲線Fig.8 Enzyme rate constant curve

3 結論

本研究通過RSM與GA-ANN兩種方法優化出豆渣酶解生成還原糖的最佳工藝為p H5.2，纖維素酶添加量4.4%，酶解溫度52℃，酶解時間3.2 h，此條件下還原糖生成量為2.65 g/kg。通過類分形動力學建立了豆渣的酶解動力學模型，該模型的R2達到0.9827，擬合效果良好。本實驗為豆渣的高效利用和后期全豆豆腐研究提供了理論支撐，但豆渣酶解生成的還原糖組分及其在全豆豆腐中的作用機制不明，還有待進一步分析研究。