剁辣椒家常加工對5種農藥殘留的影響

李凱龍，陳武瑛，陳同強，張 忞，熊志林，王 丹，陳 昂,

（1.湖南省植物保護研究所/湖南省農業科學院環境安全評價中心，湖南長沙 410125；2.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南長沙 410111）

食品加工不僅可以改變食品的品質特性，增加食品附加值，還會對食品中農藥殘留的水平產生影響[1]。在開展膳食中農藥殘留暴露評估時，考慮加工過程對農藥殘留的影響，對于正確評估農藥的膳食攝入，保障農藥暴露風險評估的準確性具有重要意義[1?3]。國內外研究表明蔬菜加工過程能減少農藥殘留水平，而不同加工過程和加工方式對減少農藥殘留效果有所不同[4]，包括清洗方式[5]、清洗劑[6]、烹飪方式[7?10]、儲存方式[11]和消毒方式[12?14]等對農藥殘留影響。大多數加工過程可在很大程度上降低食品中的農藥殘留水平，如清洗、去皮、榨汁等；但有些加工過程，如干燥或濃縮，由于受食品中水分揮發等因素的影響，使得某些農藥的殘留水平升高[15]。而對于腌制蔬菜的加工過程對于蔬菜農藥殘留的影響研究較少，特別是無氧環境下的腌制過程。

剁辣椒作為一種典型的無氧腌制加工蔬菜，其傳統加工方法是利用乳酸菌的自然發酵和食鹽保存作用進行加工處理[16]。剁辣椒的家常加工制作過程為經水洗、去蒂、晾干、切碎的辣椒及輔料放入高鹽無氧密封的條件下，利用食鹽抑制辣椒生理作用使其熟化，同時利用辣椒表面附著或后來添加的微生物發酵產生獨特風味而制成受人喜愛的剁辣椒[17]。國內學者在剁辣椒發酵工藝、發酵微生物、風味品質等方面進行了大量研究[18?20]，但對剁辣椒加工過程中農藥殘留動態的研究尚未見報道。鑒于此，本研究選擇辣椒種植過程中常用的吡蟲啉（imidacloprid）、啶蟲脒（acetamiprid）、精甲霜靈（metalaxyl-M）、嘧菌酯（azoxystrobin）和苯醚甲環唑（difenoconazole）5種農藥（結構式見圖1），同時吡蟲啉和啶蟲脒也是檢出率較高的農藥[21?22]。通過沉積農藥處理后，研究在水洗、晾干、切碎、加鹽腌制加工工藝過程中5種農藥的殘留變化情況及其加工因子，結合農藥的理化參數探索加工因子的變化規律。研究結果可為更科學的膳食評估提供基礎數據支撐，也可結合農藥的理化特性合理指導農藥的規范使用和為生產健康安全的辣椒制品提供參考。

圖1 5種農藥的結構式Fig.1 Structural formulas of 5 insecticides

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試紅線椒（Capsicum annuumL.） 購自長沙市農貿市場；5種農藥標準品（純度均大于95%） 購自德國Dr.Ehrenstorfe公司，理化性質見表1；70%吡蟲啉水分散粒劑 德國拜耳公司；20%啶蟲脒水分散粒劑 河北野田農用化學有限公司；10%苯醚甲環唑水分散粒劑、39%精甲霜靈·嘧菌酯懸乳劑 瑞士先正達公司；乙腈、甲醇 色譜純，德國MERCK默克公司；氯化鈉 優級純，上海國光試劑有限責任公司；超純水 美國Millipore公司超純水器。

表1 5種農藥的理化性質、施用劑量及最大殘留限量Table 1 Physicochemical properties,dose ratesof application and MRL of five pesticides

AB SCIEX 4500 QTRAP液相色譜-串聯質譜儀配ESI源 美國AB Sciex公司；Elix5超純水系統 美國Millipore公司；SK-1快速混勻器 浙江省金壇市科析儀器有限公司；移液槍 德國eppendorf公司；T18-B-S25勻漿儀 德國IKA公司；TP-402天平 美國Denver公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 分別稱取一定量的5種農藥制劑于20 L超純水中，配制成50 mg/L的混合溶液。稱取10.0 kg辣椒樣品置于該混合溶液中浸泡30 min后撈出、濾干，于通風處靜置24 h，即為沉積農藥后的樣品P0，用于試驗。

1.2.1.1 水洗（P1） 取沉積農藥后的辣椒樣品，在水流速為5.0 L/min的狀態下沖洗5 min，或者在清水中浸泡水洗5 min后濾干水，取300 g樣品（3份，100 g/份）粉碎備用。

1.2.1.2 晾干（P2） 分別取經水洗后的辣椒樣品置于陰涼處吹干水氣，之后從中取300 g樣品（3份，100 g/份）粉碎備用。

1.2.1.3 切碎（P3） 分別取經水洗、晾干后的辣椒樣品用干凈的刀具、砧板將辣椒切碎，取300 g樣品（3份，100 g/份）備用。

1.2.1.4 加鹽腌制（P4） 分別取經水洗、晾干、切碎后的9.0 kg辣椒樣品，加入0.9 kg食鹽，充分攪勻，放置5 min，待辣椒腌出汁來，取300 g樣品備用，再分裝于3個密封壇子中腌制，分別在腌制后的2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和21 d取300 g樣品（3份，100 g/份）備用。

1.2.2 樣品的提取、凈化與檢測 參照文獻中的QuEChERS方法[23]，并進行改進后，進行提取和凈化。稱取均質的辣椒樣品5.00 g（精確至0.1g）于50 mL塑料離心管中，再加入10.0 mL含1%（v/v）乙酸的乙腈溶液、600.0 mg無水MgSO4和1.0 g氯化鈉，振蕩提取10 min后在5000 r/min下離心5 min，取出乙腈層于100 mL雞心瓶中，再加10 mL乙腈重復提取1次，均質離心后合并乙腈層，將提取液于40℃水浴旋轉蒸發至約0.5 mL。少量多次加入乙腈渦旋溶解并定容至10.0 mL，取5.0 mL于預先加入200.0 mg C18填料的離心管中，渦旋提取15 s，在5000 r/min下離心5 min，取上層提取液1.0 mL，過0.45μm有機相濾膜后，上機分析測定。

1.2.3 標準儲備液和工作溶液的配制 農藥標準儲備液（100.0μg/mL）的配制：取適量的農藥標準物質，用乙腈稀釋成100.0μg/mL的儲備液，于?20℃冰箱避光保存。準確吸取一定體積的各農藥標準儲備液，用乙腈定容，得到5種農藥1.0μg/mL的標準中間液，于?20℃冰箱避光保存。基質標準液的配制：稱取5.0 g空白辣椒樣品共7份，進行樣品1.2.2的前處理過程后，由此獲得空白基質溶液。準確吸取一定量的各農藥標準中間液或標準儲備液于1.0 mL容量瓶中，用空白基質液定容，配制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L系列標準溶液，現配現用，以峰面積(y)和質量濃度(x)作標準工作曲線，采取外標法定量。

1.2.4 檢測條件 色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8μm），流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈，流速0.4 mL/min，柱溫30℃，進樣量1.0μL。流動相梯度洗脫條件：0～0.8 min，90%A；0.8～2.8 min，90%A～50%A；2.8～4.8 min，50%A～10%A；4.8～6.8 min，10%A；6.8～7.8 min，10%A～90%A；7.8～10.0 min，90%A。

質譜條件：離子化電壓5.5 k V，離子源溫度500℃，氣簾氣壓力40 psi，噴霧氣壓力45 psi，5種農藥均采用液相色譜-三重四極桿質譜多反應監測模式測定，具體參數分別見表2。

表2 5種農藥的LC-MS/MS分析參數Table2 Experimental parametersand LC-MS/MSconditionsof the pesticidesstudied.

1.3 數據處理

采用Excel表格進行數據統計和作圖，利用SPSS軟件對數據進行統計分析，兩個處理數據采用t檢驗進行比較，兩個以上處理數據采用兩因素方差分析（Two-way ANOVA）進行比較，P值<0.05視為不同處理具有顯著性差異的判定標準。

加工因子PF（processing factor）是指產品中農藥殘留量與原料中的農藥殘留量比值[24]，本研究用加工因子來衡量剁辣椒不同加工工序處理后農藥殘留量的變化情況，其計算公式如下：

式中：c0表示加工前樣品中農藥含量平均值；c表示經過加工處理后樣品中農藥含量平均值。單位均以mg/kg計。

農藥暴露風險評估計算：

其中IEDI（International Estimated Daily Intake）為國際日攝入估計（mg/kg bw），STMRi（Supervised Trials Median Residue）、Ei、Pi和Fi分別指農藥殘留的中位數水平、食品可食部分因子、食品的加工因子和膳食消費量[25]。為了簡化評估過程，中位數STMRi采用初始樣品中的測定值（mg/kg），Ei=1，Pi為試驗的加工因子，Fi為引用汪曉銀等的數據，計算我國城市人口每天蔬菜的平均消費量為335 g[26]；ADI為每千克體重的農藥日允許攝入量（mg/kg），bw為我國人均體重，一般按60 kg計算。

2 結果與分析

2.1 分散固相萃取條件優化

常用的分散固相萃取的凈化吸附劑主要有選擇離子交換吸附劑（primary secondary amine，PSA）、惰性吸附劑（C18）和石墨化炭黑，研究發現石墨化炭黑吸附劑能去除食品基質中的色素和甾醇的影響，但本研究中發現石墨化炭黑對精甲霜靈和嘧菌酯的吸附作用較大，添加回收率較低（43.2%～56.7%），不宜采用；故選用對多糖、肽類（包括氨基酸）和色素有強吸附作用的PSA和對色素和油脂等弱極性雜質有較強保留作用的C18作為固相萃取劑進行凈化處理[27]。本實驗比較了40 mg/mL PSA、80 mg/mL PSA、40 mg/mL C18和80 mg/mL C18四組凈化劑對空白基質中添加水平為0.1 mg/kg的5種農藥凈化效率的影響，結果表明，在1.0 mL待凈化液中添加80 mg凈化劑后5種農藥的回收率較添加40 mg凈化劑低，而添加40 mg PSA和40 mg C18對5種農藥的回收率沒有顯著差異（5種農藥回收率平均值分別為91.4%和92.3%），但C18凈化得到的色譜峰基質影響更小，凈化效果要優于PSA，因此選擇C18作為本試驗的固相萃取材料。

2.2 色譜分析方法確證結果

吡蟲啉、啶蟲脒、嘧菌酯、精甲霜靈和苯醚甲環唑標準系列溶液按照1.2.4節LC-MS/MS方法進行分析，每個基質標曲濃度進樣3次，以質量濃度為x軸，峰面積為y軸，繪制標準曲線，得到上述5種化合物的線性回歸方程及相關系數，結果見表3。結果顯示，上述5 種化合物的線性回歸系數R2在0.99699～0.99950之間，能滿足定量分析要求。

以0.01、0.1和1.0 mg/kg 3個水平添加混合標準液到空白辣椒樣品中，然后按1.2.2節方法對樣品進行分析，每個添加水平做10次平行，計算辣椒中各農藥的回收率及變異系數，結果見表3。結果顯示，辣椒中5種農藥的平均回收率在85.4%～100.4%之間，相對標準偏差在1.5%～8.3%之間。表明本方法的準確度和精密度均符合農藥殘留分析要求[28]，能夠滿足實際樣品的殘留檢測分析，空白基質A、基質標準溶液B和加藥剁辣椒樣品C中5種農藥的總離子色譜圖見圖2。

圖2 5種農藥的總離子色譜圖（TIC）Fig.2 Total ion chromatogram (TIC)of 5 pesticides

表3 辣椒中5種農藥的線性回歸系數、加標回收率及其相對標準偏差Table3 Regression coefficients(R2),recovery and relative standard deviation (RSD)in linearity conditionsfor the pesticides studied in lettuce

2.3 剁辣椒的水洗方式和水洗時間對農藥殘留的影響

吡蟲啉、啶蟲脒、精甲霜靈、嘧菌酯和苯醚甲環唑5種農藥的log Kow值在0.57～4.36之間，從表4可以看出，沖洗處理方式較浸泡水洗方式對5種農藥的去除效果均較好，不同農藥在水洗過程中，農藥的log Kow值越大，水洗處理對該農藥的去除效果越差，且隨著加工時間的增加PF的變化幅度越小。苯醚甲環唑的logKow值為4.36，隨時間的增加，PF值雖有減小的趨勢，但減小的幅度較小，而吡蟲啉和啶蟲脒的log Kow值均小于1，隨時間的增加PF值減小程度較大，在沖洗10 min后，吡蟲啉和啶蟲脒的PF值可分別達到0.54和0.59。從浸泡和沖洗方式對5種農藥的去除效果看，吡蟲啉的去除效果最為明顯，而苯醚甲環唑的去除效果最差，且沖洗方式較浸泡方式對農藥的去除效果明顯。

表4 剁辣椒不同水洗方式和不同時間對5種農藥的加工因子Table 4 Processing factors of five pesticide residues with different treatments in chopped pepper

2.4 剁辣椒的加工過程對農藥殘留的影響

剁辣椒在未加工和不同階段加工過程中農藥殘留水平見圖3。結果表明，在農藥沉積實驗中，在用藥劑量相同的情況下，5種農藥在辣椒中的初始沉積量具有較大差異，特別是苯醚甲環唑的初始沉積量遠遠大于其他4種農藥，說明不同藥劑在辣椒中的殘留水平有差異，這可能與苯醚甲環唑的高log Kow值和高滲透性等有關。初剁辣椒不同加工階段對所有農藥的影響有相似之處，5種農藥殘留在經過整個剁辣椒加工工序后的農藥殘留均有大幅下降，且在用水沖洗時均出現明顯下降，不同洗滌方式（包括水浸泡5 min和水沖洗5 min）去除的農藥殘留有差別，且用水沖洗去除農藥殘留效果更好。不同清洗方式對豇豆種農藥殘留的影響研究中也發現，沖洗和振動清洗較浸泡清洗對農藥殘留的清除效果好[8]。而不同農藥的降解率的差異可能與農藥的理化特性有關，因為農藥的log Kow值越高越容易進入農產品表面的蠟質層，清洗時不易溶解在清洗液中而被去除，故很難降低農產品上這些農藥的殘留量[29]。

圖3 剁辣椒加工過程中的農藥殘留水平Fig.3 Pesticide residues in chopped pepper during processing

剁辣椒水洗后的晾干和切碎過程對5種農藥殘留的去除作用不明顯，表5結果表明，晾曬過程5種農藥的加工因子在0.91～1.03之間，而切碎過程5種農藥的加工因子在0.88～0.99之間。加鹽腌制過程對5種農藥的殘留影響有差異，log Kow值小于2的吡蟲啉、啶蟲脒和精甲霜靈三種農藥，加鹽腌制2 h的加工因子分別為0.91、1.00、0.96；而logKow值大于2的嘧菌酯和苯醚甲環唑，加鹽腌制2 h的加工因子分別為0.71和0.47，說明農藥的log Kow值越大，加鹽腌制處理對該農藥的去除效果越好，這與水洗過程中的加工因子關系相反。黃瓜加工過程對農藥加工因子影響也有類似現象，吡蟲啉（log Kow值=0.57）加鹽腌制2 h的加工因子為0.91，而氯氰菊酯（log Kow值=6.30）加鹽腌制2 h加工因子為0.68[30]。這些規律為降低log Kow值較高農藥的殘留量提供了一種加工處理方式的新思路。

表5 剁辣椒不同加工階段對5種農藥的加工因子Table 5 Processing factors of five pesticide residues with different treatmentsin chopped pepper

隨著剁辣椒腌制時間的增加，在腌制0～7 d農藥的殘留量下降較快，但7 d后殘留量下降很緩慢，特別是14 d后5種農藥的加工因子均大于0.85，說明在剁辣椒腌制后期這5種農藥的降解速率變慢了。剁辣椒在加鹽腌制后是一種由有氧環境逐漸變為無氧環境的過程，剁辣椒中的好氧微生物逐漸被厭氧乳酸菌所代替，而這可能是在腌制后期剁辣椒中農藥降解速率變慢的原因。

盡管剁辣椒整個加工過程中5種農藥在不同加工階段的加工因子有所不同，但從整個加工過程分析發現，加工全過程對5種農藥的殘留去除效果均比較明顯，剁辣椒加工全過程（至腌制21 d止），吡蟲啉、啶蟲脒、精甲霜靈、嘧菌酯和苯醚甲環唑的全過程加工因子分別為0.20、0.32、0.23、0.21和0.14。

2.5 加工方式對消費者的農藥暴露風險的影響

在風險評估中一般用農藥殘留攝入的最大理論日攝入估計（Theoretical Maximum Daily Intake，TMDI）評估農藥的暴露風險，但由于以MRL為農藥殘留水平，往往高于實際殘留水平，所以造成過高估計。所以一般用國際日攝入估計（International Estimated Daily Intake，IEDI）作為TMDI的評估校正，農藥殘留的風險指數越低，說明攝入膳食越安全。根據試驗數據和公式，計算剁辣椒加工對食用剁辣椒的風險指數的影響。從表6可以看出，經過剁辣椒家常腌制21 d后5種農藥的農藥殘留的膳食暴露量大大降低，膳食風險指數分別較未加工降低了80.6%、68.7%、76.3%、78.4%、85.9%。

表6 試驗農藥的膳食暴露風險指數Table6 Risk index of dietary exposure for tested pesticide

3 結論

綜上所述，吡蟲啉、啶蟲脒、精甲霜靈、嘧菌酯和苯醚甲環唑的全過程加工隨著加工時間的增加農藥殘留量呈降低的趨勢，全過程加工因子分別為0.20、0.32、0.23、0.21和0.14。而5種農藥在剁辣椒加工不同加工階段的加工因子規律有所不同，吡蟲啉、啶蟲脒和精甲霜靈的水洗PF值在整個加工過程中最小，而嘧菌酯和苯醚甲環唑的加鹽腌制PF值在整個加工過程中最小。本研究發現引起剁辣椒不同加工階段對農藥殘留影響的差異可能與農藥本身的理化特性密不可分，log Kow（辛醇水分配系數）值小的農藥，在水洗處理下的殘留量少，且沖洗處理較浸泡處理去除農藥效果好；而log Kow值大的農藥，在加鹽腌制處理下的殘留量少，且在剁辣椒腌制的無氧環境中農藥降解速率逐漸變緩。

剁辣椒加工過程可減少農藥殘留的膳食風險指數，通過將辣椒產品加工成剁辣椒的方法來降低辣椒中的農藥殘留，減少其膳食攝入量。試驗結果表明，經過家常剁辣椒加工腌制21 d后5種農藥的膳食風險指數分別較未加工降低了80.6%、68.7%、76.3%、78.4%、85.9%。因此希望有關部門應結合農產品加工工藝和農藥的理化特性合理評估膳食中的農藥暴露水平，同時希望通過不斷優化農產品加工工藝以減少農產品中的農藥殘留，保障農產品質量安全。