基于頂空氣相-離子遷移色譜的不同品種番荔枝揮發性成分比較

楊濤華，張晴雯，龔 霄, ，李積華, ，周 偉

（1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業農村部熱帶作物產品加工重點實驗室，廣東湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東湛江 524001）

番荔枝（Annona squamosaLinn.），為番荔枝科番荔枝屬落葉喬木。果肉滋味甜，口感細膩綿密，營養豐富，是熱帶地區代表性水果之一。番荔枝風味獨特，不同品種番荔枝揮發性化合物組成和含量不同，因此導致了番荔枝香氣的品種間差異[1]，故而香氣可以作為番荔枝分類的重要參考指標。

近年來，常用于鑒定食品中揮發性香氣化合物的儀器分析技術主要有：氣相色譜-質譜法（Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS）[2]，氣相色譜-嗅覺法-質譜（Gas chromatography-olfactometrymass spectrometry，GC-O-MS）[3]和電子鼻[4]。但這些技術均受限于預處理程序和樣品種類要求，無法滿足快速檢測分析的要求[5?6]。離子遷移譜（Ion mobility spectrometry，IMS）作為一種新興技術具有許多優點，如檢測速度快、靈敏度高、操作簡便、樣品制備步驟簡單，將IMS與氣相色譜結合使用可以更好地表征風味成分[7]。

氣相色譜-離子遷移譜儀（Gas chromatographyion mobility spectrometry，GC-IMS）結合了GC的高分離能力和IMS的快速響應特性提供了一種新的氣相分離和檢測技術。已廣泛用于食品風味分析、可卡因等非法藥物的痕量檢測[8]以及通過檢測人呼出氣體揮發性有機化合物和人類皮膚釋放揮發性化合物監測和預先判別疾病[9?10]等，尤其是食品風味分析。不僅用于分析特征風味，如白葡萄酒的分類鑒別[11]，以蛋殼表面呼吸物的含量和濃度來判別雞蛋的新鮮程度[12]，伊比利亞火腿的摻假鑒別[13]，棗果變黑過程中棗果實成分和揮發性化合物的含量變化[14]，還有將HS-GC-IMS成像與化學計量學和分子標記識別結合來區分不同花源蜂蜜和摻假蜂蜜[15]、山茶油摻假鑒別[16]、肉品分類[17]、番荔枝貯藏品質評價[18]等。在水果風味化合物分析領域，楊帆等[19]采用頂空-氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）和全二維氣相色譜-嗅聞-質譜（GC×GC-0-MS）結合分別分析新鮮和熱處理西瓜汁中的氣味化合物，確定了2,6-二甲基-5-庚烯醛是西瓜產生甜瓜、清香氣味的化合物，而包括戌醛、己醛、2-戊基呋喃、辛醛等化合物含量在熱處理前后的變化則導致西瓜汁熱處理后產生蒸煮味和含硫味。于懷智等[20]應用頂空氣相離子遷移譜技術分析了不同產地水蜜桃揮發性有機物差異，通過建立相應的指紋圖譜能較高效地鑒別不同產地水蜜桃。李湘等[21]基于氣相色譜-離子遷移譜技術（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析不同處理前后柑橘果皮揮發性化合物變化，采用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）篩選出17個標志揮發性化合物（VIP>1），并對其進行熱圖聚類分析，發現了不同處理對柑橘果皮揮發性化合物的影響。事實證明，在水果等食品風味分析領域，GC-IMS以其高效無損、操作簡單、靈敏度強的優勢廣泛應用于表征揮發性化合物[22?23]。因此，利用GC-IMS技術檢測番荔枝風味物質，并根據特征風味化合物構建品種指紋圖譜和鑒別模型是可以實現的。

本試驗利用GC-IMS技術檢測番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝、刺果番荔枝等4種番荔枝的香氣成分，建立不同品種番荔枝揮發性風味物質指紋圖譜。根據數據的差異性，對不同品種番荔枝進行區分，為番荔枝品種識別、全品種香氣研究提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番鬼荔枝 采購于廣東徐聞馬以貿易有限公司；大目番荔枝 購于廣西百色平果縣；紅番荔枝采購于廣東徐聞馬以貿易有限公司；刺果番荔枝 購于海南儋州翊盛貿易有限公司，采后全程冷鏈運輸至實驗室。

FlavourSpec?風味分析儀 德國G.A.S公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法 由于新鮮番荔枝果肉風味化合物不穩定、逸散不充分，易導致檢測數據不穩定。且使用新鮮果肉進行揮發性化合物測定常以4-甲基-2-戊醇作為內標，對檢測出的揮發性化合物進行相對定量，檢測結果存在較大誤差。因此本試驗采用果肉速凍粉末進行風味分析。具體操作如下：番荔枝去皮，并將果肉快速切成薄片。將果肉液氮速凍并研磨成粉末，準確稱量2.0 g粉末于20 mL頂空進樣瓶中，用作香氣試驗。每個樣品做三次平行試驗。

1.2.2 GC-IMS檢測條件 頂空孵化溫度：60℃；孵化時間：10 min；孵化轉速：500 r/min；頂空進樣針溫度：65℃；進樣量：500μL，不分流模式；清洗時間：0.50 min；色譜柱為FS-SE-54-CB-1 15 m ID:0.53 mm，柱溫60℃，色譜運行時間20 min，載氣為高純氮氣（≥99.999%）；設置程序：流速2.00 mL/min，并保持2 min，在20 min內線性增至100.00 mL/min。IMS條件：IMS溫度為45℃，載氣為高純氮氣（≥99.99%）；流速150.00 mL/min。將頂空進樣瓶中的樣品進行孵化，使用加熱的進樣針抽取瓶內的頂空組分，GCIMS分析測定。定性定量方法：將IMS數據庫里相應揮發性化合物的標準曲線作為參考基準，一一對應測定樣品揮發性化合物的種類及含量。

1.3 數據處理

采用儀器配套的分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及GC×IMSLibrary Search，進行多角度樣品分析。LAV軟件：用于查看分析譜圖，圖中每一個點代表一種揮發性有機物；對其建立標準曲線后可進行定量分析。Reporter插件：直接對比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖和三維譜圖）。Gallery Plot插件：指紋圖譜對比，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發性有機物差異。Dynamic PCA插件：動態主成分分析，用于將樣品聚類分析，以及快速確定未知樣品的種類。GC×IMS Library Search：應用軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫可對物質進行定性分析。

風味物質濃度以μg/L表示。用GC-IMS測得風味物質的峰強度單位為ppb，將ppb作為濃度單位換算成μg/L，參考基準是IMS數據庫里相應揮發性化合物的標準曲線。

采用軟件SPSS V 20版（IBM SPSS Statistics 20）對數據進行顯著性差異分析。處理三個平行數據并將其最終表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 不同品種番荔枝特征風味氣相-離子遷移色譜（GC-IMS）譜圖分析

圖1、圖2分別是LAV軟件中Reporter插件所制作的三維譜圖和俯視圖。從三維譜圖（圖1）中可以直觀看到四種番荔枝間含有揮發性化合物的種類及含量存在差異，除了獨有的揮發性化合物外，四種番荔枝均有的揮發性化合物含量也不同。而在俯視圖（圖2）中：RIP峰兩側的每一個點代表一種揮發性有機物。顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。圖2中的物質編號對應表1中化合物。

圖1 不同品種番荔枝果肉特征風味的GC-IMS三維譜圖Fig.1 Three dimensional GC-IMSimagesof characteristic flavor of different Annona squamosa Linn. pulp

結合三維譜圖和俯視圖，能初步判斷出刺果番荔枝（d）揮發性化合物的種類明顯區別于其他三種，且揮發性化合物含量更為豐富。根據表1，同一種揮發性化合物的含量在不同品種番荔枝樣品中存在顯著差異。結合俯視圖（圖2）和番荔枝果肉揮發性物質表（表1）的分析可以得出，刺果番荔枝的風味成分以丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯等酯類物質為主，且丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯幾種成分在刺果番荔枝中的含量水平為300μg/L，遠高于這幾種成分在其它3種番荔枝為30μg/L左右的含量水平。而酯類能顯著影響成熟水果的特征風味，給水果帶來柑橘類清新香氣[24?25]。番鬼荔枝、大目番荔枝和紅番荔枝中則以檸檬烯、月桂烯、莰烯、γ-松油烯等萜烯類物質為主，而萜烯類物質給水果帶來令人愉悅的玫瑰和檸檬香氣[24?25]。檸檬烯、月桂烯、莰烯、γ-松油烯在番鬼荔枝、大目番荔枝和紅番荔枝中含量（200～300 μg/L）遠高于其在刺果番荔枝中的含量（3～10μg/L），且存在顯著差異（P<0.05）。刺果番荔枝中萜烯類物質含量較低，含量水平處于0.25～3.5μg/L，因此刺果番荔枝無明顯玫瑰和檸檬香氣，這可作為快速判斷刺果番荔枝的重要指標。

表1 番荔枝果肉揮發性化合物Table 1 Volatile compounds of Annona squamosa Linn.pulp

圖2 番荔枝果肉特征風味的GC-IMS譜圖Fig.2 GC-IMSimages of characteristic flavor of Annona squamosa Linn. pulp

2.2 不同品種番荔枝特征風味離子遷移色譜（GCIMS）指紋圖譜分析

有機指紋圖譜中每一行代表一個番荔枝果肉中選取的全部信號峰，每一列代表同一揮發性有機物在不同番荔枝果肉中的信號峰。從圖3中可以看出每種樣品的完整揮發性有機物信息以及樣品之間揮發性有機物的差異。

由圖3可知：不同品種番荔枝果肉的揮發性化合物組分差異顯著，均存在各自特征風味物質區域。番鬼荔枝（a）的特征風味物質，即菱形標記的芳樟醇（風信子香）、1,8-桉葉素、苯甲醛（苦杏仁香）、甲基庚烯酮、2-甲基丙酸、γ-松油烯等物質，這些物質在番鬼荔枝（a）中含量較高，給其帶來了風信子和苦杏仁香氣；大目番荔枝（b）的特征風味物質，則是三角形標記的檸檬烯、月桂烯、莰烯（柔和樟腦香）、β-蒎烯、α-蒎烯、1-己醇（生青、青草）、己醛、2-己酮、丙酮（薄荷香）、丁醛等物質含量較高；刺果番荔枝（d）的特征風味物質，即圓形標記的E-2-己烯醇（生青味、草藥味）、丙酸乙酯、辛酸乙酯（果香，菠蘿、梨香，花香）、丁酸己酯、辛酸甲酯（蠟味、蘋果皮味、果香）、己酸乙酯（花香、果香）、4-甲基戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯（蘋果、草莓、香蕉味）、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丙酯（果香、苦味）、E-2-辛烯醛、1-辛醇（濃郁的柑橘、玫瑰）、3-甲基丁醇、2-庚酮（梨、香蕉味）、2-戊酮、乙酸乙酯（蘋果味）、乙醇、3-甲基丁醛等物質含量較高；紅番荔枝（c）的風味物質濃度較低，番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝中存在較多的萜烯類物質，而刺果番荔枝則以酯類物質為主，與Costa、Cheong等[26?27]的研究結論相一致。

圖3 番荔枝果肉特征風味的指紋圖譜Fig.3 Fingreprients information of characteristic flavor of Annona squamosa Linn.pulp

不同揮發性化合物組分會讓樣品呈現不同的香氣感受。芳樟醇會帶來風信子[28]的香氣，1-己醇、丙酮、E-2-己烯醇會給樣品帶來青草、薄荷等草本類植物香氣[28]。而辛酸乙酯、辛酸甲酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、1-辛醇、2-庚酮、乙酸乙酯常被描述為花果類香氣[29]。

2.3 不同品種番荔枝特征風味主成分分析

采用LAV軟件Dynamic PCA插件，對番荔枝果肉樣品進行主成分分析（PCA），觀察圖4A可得：前兩個主成分上方差累計貢獻率91.986%，其中第一主成分（PC1）是73.285%，第二主成分（PC2）是18.701%。在主成分分析圖中，可以直觀看到四種番荔枝各自聚類，區分度明顯。

由樣品風味物質的得分與載荷圖即圖4B中可知，刺果番荔枝（d）與酯類和酮類化合物距離較近，說明刺果番荔枝（d）中酯類、酮類化合物含量較高，更多地呈現出花果類香氣；番鬼荔枝（a）與苯甲醛等醛類化合物距離較近，即番鬼荔枝（a）中苯甲醛含量較高，而苯甲醛通常表現為苦杏仁香氣；蒎烯、松油烯、羅勒烯、月桂烯、檸檬烯、莰烯等萜烯類化合物與紅番荔枝（c）位置接近，說明紅番荔枝（c）含有上述多種的萜烯類化合物，因此香氣以萜烯類化合物呈現的草本類香氣為主。

圖4 番荔枝風味成分得分與載荷圖Fig.4 Score and load chart of aroma compounds of Annona squamosa Linn.samples

3 結論與討論

本試驗利用GC-IMS技術檢測番荔枝香氣成分，通過對番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝、刺果番荔枝四個不同品種番荔枝香氣成分的分析和比較，確定了各品種特征香氣成分以及特征信號峰。研究發現：在番鬼荔枝中，芳樟醇、1,8-桉葉素、苯甲醛、甲基庚烯酮、2-甲基丙酸、γ-松油烯等物質含量較高；而檸檬烯、月桂烯、莰烯、β-蒎烯、α-蒎烯、1-己醇、己醛、2-己酮、丙酮、丁醛等物質在大目番荔枝中含量較高；刺果番荔枝中E-2-己烯醇、丙酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸己酯、辛酸甲酯、己酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丙酯、E-2-辛烯醛、1-辛醇、3-甲基丁醇、2-庚酮、2-戊酮、乙酸乙酯、乙醇、3-甲基丁醛等物質含量較高。紅番荔枝的風味物質濃度較低。參考利用揮發性有機物差異鑒別水蜜桃產地[20]的研究思路，進一步對數據進行多元統計分析，發現PCA能基于香氣成分對番荔枝品種進行有效區分，4種番荔枝與其特征風味化合物各自聚類，結果顯示番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝檢出的揮發性化合物以萜烯類物質為主，而刺果番荔枝中酯類物質占比較大。

GC-IMS作為近年來食品風味化學領域熱門的技術手段，已在酒類[11]、蜂蜜[15]、水果風味化合物檢測[19?21]等方面進行了探索并得到了一些研究結論。本研究比較了番鬼荔枝、大目番荔枝、紅番荔枝、刺果番荔枝的香氣成分并構建了四種番荔枝香氣成分指紋圖譜，但截止目前，由于IMS數據庫在番荔枝風味領域的數據還不完善，只定性定量出49種揮發性化合物，需要進一步檢測其它不同品種番荔枝的風味物質，擴充番荔枝風味物質數據庫，為構建全品種番荔枝風味物質提供數據基礎。