基于聚類分析的白茶高效液相色譜指紋圖譜研究

王世博，寧洪鑫，黃龍岳，姚薛超，李祎亮，侯文彬,

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.北京協和醫學院&中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室，天津 300192）

白茶為我國六大茶類之一，屬于微發酵茶，主要產地為福鼎、政和、建陽和松溪，以福鼎白茶品質最佳[1?2]。白茶為我國特有品種，其制備工藝簡單，有效地保留了茶葉中的營養成分，富含維生素，氨基酸、茶多糖、茶多酚、茶色素、黃酮、生物堿等，具有極高的營養價值[3?5]。現代研究表明白茶有很好的三降三抗（降血壓、降血脂[6]、降血糖[7]、抗氧化[8?10]、抗腫瘤[11]、抗輻射[12?13]）的作用，還可以抗真菌[14]、解酒[15]、清除自由基[4]、調節神經紊亂[16]和延緩衰老[17]。

近年來白茶相關研究不斷增加[5]，目前的研究主要有：白茶制備工藝[18?19]，化學成分組成與鑒定，白茶藥理作用和衍生產品研究、開發[20?22]等。白茶質量控制和鑒別以感官評判為主，缺乏客觀性。有學者將白茶作為組合研究對象，進行了香氣成分鑒別[23]及指紋圖譜初探[24?26]。關于白茶HPLC指紋圖譜的系統研究尚不完善，其鑒別方法亟待提高。

本文采用中藥指紋圖譜與現代技術相結合的方法，對白茶多組分復雜體系進行質量評價[27]，可以提供豐富的鑒別信息，便于白茶及其衍生產品的開發與研究。試驗主要收集12批不同品種、年份的白茶進行研究，建立白茶的高效液相的指紋圖譜，對12批白茶進行成分分析和聚類分析，為白茶的質量控制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12批白茶樣品 按照GB/T30766-2014《茶葉分類》[28]標準進行處理，分別研磨過40目篩，放置于密封、干燥、溫度20℃條件下儲藏備用，樣品的種類屬性見表1；乙腈、甲醇 色譜純，天津康科德公司；乙酸 色譜純，天津市風船化學試劑科技有限公司；表兒茶素沒食子酸酯（ECG） 批號：111987-201501，中國食品藥品檢定研究所；表兒茶素（EC）批號：110878-200102，中國藥品生物制品檢定所；表沒食子兒茶素（EGC） 批號：DST190703-038，樂美天醫藥德思特生物；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG） 批號：DST191107-036，樂美天醫藥德思特生物；沒食子酸（GA） 批號：SDT190715-008，純度≥98.0%，樂美天醫藥德思特生物；咖啡堿（CAF） 批號：C11693000，純度≥98.0%，Ehrenstorfer，德國。

表1 茶葉樣品生產信息Table 1 Tea sample production information

Waters 2695-2998高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器、Empower 3數據工作站 美國Waters公司；KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SQP十萬分之一天平 賽多利斯；AX124ZH萬分之一天平 奧豪斯；純水機 密理博；TD-5M低速離心機 四川蜀科儀器有限公司；HH-ZK-4智能數顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 對照品溶液：稱取咖啡堿20 mg，EC、GA、EGC、ECG、EGCG各10 mg置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。量取上述標準品儲備液各1.0 mL于10 mL容量瓶，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45μm濾膜濾過，作為對照品溶液，備用。

供試樣品溶液：稱取茶葉樣品0.2000 g置于10 mL離心管中，加入經70℃預熱過的70%的甲醇5 mL，并于70℃水浴中浸提10 min，隔5 min攪拌一次，轉移上清液于離心管中，殘渣用5 mL的70%甲醇溶液提取，合并兩次提取液放至室溫，于3500 r/min條件離心10 min，取上清液置10 mL量瓶中，加入70%甲醇定容，搖勻。取上述溶液2.0 mL置于10 mL量瓶，用70%甲醇定容，搖勻，經0.45μm濾膜濾過，作為對照品溶液，備用[29]。

1.2.2 白茶指紋圖譜建立 取12批白茶樣品在“1.2.1”條件制備成供試樣品溶液，進行高效液相色譜指紋圖譜的分析。色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.5%乙酸；檢測波長258 nm；柱溫35℃；進樣量10μL；檢測時長60 min。洗脫程序見表2。以咖啡堿的色譜峰為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積比值。保存樣品液相色譜圖，并將數據導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”軟件進行處理，生成相應的白茶高效液相色譜指紋圖譜。

表2 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 2 Program of HPLCgradient elution

1.2.3 指紋圖譜方法學考察

1.2.3.1 咖啡堿線性關系考察 精密稱取咖啡堿20 mg于10 mL容量瓶用70%甲醇定容，作為咖啡堿儲備液。吸取咖啡堿250、500、750、1000、1250μL于10 mL容量瓶用70%甲醇定容至刻度，搖勻，制得含量為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g·L?1濃度的咖啡堿標準溶液，按“1.2.2”項條件下測定。

1.2.3.2 儀器精密度 稱取白茶樣品G9白牡丹，在“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.2”項條件下測定，連續進樣6針，選取其中峰面積大的10個峰作為共有峰（下同），記錄10個共有峰的保留時間和峰面積，以咖啡堿為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積。

1.2.3.3 穩定性考察 稱取白茶樣品G9白牡丹，在“1.2.1”項下制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、18、24 h按“1.2.2”項條件下測定，記錄10個共有峰的保留時間和峰面積，以咖啡堿為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積。

1.2.3.4 重復性考察 稱取白茶樣品G9白牡丹6份，在“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.2”項條件下測定，記錄10個共有峰的保留時間和峰面積，以咖啡因為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積。

1.2.3.5 高效液相色譜法的白茶指紋圖譜相似度的計算12批白茶的樣品在“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.2”項條件下測定，記錄茶葉樣品在258 nm條件下的色譜圖，并將數據導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”進行色譜峰匹配，色譜峰匹配條件設置為平均數法，時間窗寬度為0.5，通過多點校正進行峰匹配，并計算樣品之間的相似度。

1.2.3.6 聚類分析 為進一步考察不同批次間的差異，采用系統聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）對12批次白茶的數據進行分析，觀察不同批次白茶間的差異。在SPSS18.0軟件中導入12批樣品相對峰面積，聚類法采用組間均聯法，選用夾角余弦為刻度距離作為分類依據[30]，分析不同白茶樣品之間的親疏程度。

2 結果與分析

2.1 提取方法與色譜條件選擇分析

2.1.1 提取溶劑的選擇 分別選擇50%、60%、70%、80%、90%甲醇和50%、70%乙醇進行提取溶劑篩選，考察過程中發現采用50%、60%甲醇和50%乙醇時，白茶易漂浮于液面，浸提效果較差，故對70%、80%、90%甲醇和70%乙醇提取的樣品進行液相色譜分析，結果如圖1所示，提取溶劑選用70%乙醇時，色譜分離度和峰形欠佳，選用70%、80%、90%甲醇作為提取溶劑，其色譜圖分離度和峰形俱佳，無明顯差異，從提取成本和環保的角度考慮，未選用80%甲醇與90%甲醇，最終選用70%甲醇作為本方法的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑考察的色譜圖Fig.1 Chromatogramsof different extraction solvent

2.1.2 流動相的選擇 理想的流動相可以更好地分離化合物，首先對比甲醇-水和乙腈-水兩種流動相，如圖2所示，可以看出乙腈-水作為流動相時色譜峰多，分離度好，進而在乙腈-水體系的基礎上進行調整優化，采用乙腈?0.5%乙酸作為流動相進行考察，該條件峰形得到了進一步改善，最終確定本法流動相為乙腈?0.5%乙酸體系。

圖2 不同流動相考察的色譜圖Fig.2 Chromatograms of different mobile phases

2.1.3 流動相梯度考察 由于白茶提取成分多且復雜，性質差別較大，因此，實驗選用梯度作為流動相的洗脫方式。對比了下述幾種梯度條件，梯度條件見表3，結果如圖3所示，可以看到圖3d的色譜圖中的色譜峰較多，峰形較佳，確定為本實驗的梯度條件。

表3 高效液相色譜梯度考察Table 3 Program of HPLCgradient study

圖3 不同梯度考察的色譜圖Fig.3 Chromatogramsof different gradients

2.1.4 波長的選擇 白茶中多酚類和生物堿類成分液相色譜的最大吸收波長多集中在270～280 nm之間，以270～280 nm為軸，選取240、258、270、280、300 nm幾個波長，結果如圖4所示，258 nm時基線平穩，色譜峰較多，容易分辨。經綜合考慮確定以258 nm作為本方法的檢測波長。

圖4 不同波長考察的色譜圖Fig.4 Chromatograms of different wavelengths

2.1.5 不同流速的考察 選取0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min，考察了不同流速對分析方法的影響，結果如圖5所示，隨著流速升高，出峰時間整體前移，流速在0.8 mL/min時出峰早，峰分離度較好。因此，本實驗的液相方法中主體流速選擇0.8 mL/min。

圖5 不同流速的色譜圖Fig.5 Chromatogramsof different flow rates

2.1.6 柱溫的確定 經考察柱溫為25、30、35℃時，色譜圖如圖6所示，色譜圖未見明顯差異，考慮到環境溫度的變化等因素，最終確定柱溫為35℃。

圖6 不同柱溫的色譜圖Fig.6 Chromatograms of different column temperatures

2.1.7 參比對照峰的選擇 參比對照峰的選擇通常以保留時間和峰面積為指標，在指紋圖譜的測定過程中發現咖啡堿保留時間居中，且峰面積較大，故選取咖啡堿作為參比對照峰。

2.2 指紋圖譜方法學考察結果

2.2.1 咖啡堿線性關系 以峰面積為y軸，質量濃度為x軸求得回歸方程為y=21031x+77833，r=0.9999，線性關系良好。

2.2.2 儀器精密度 精密稱取樣品G9，在“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.2”項條件下測定，記錄10個共有峰的保留時間和峰面積，并以咖啡堿為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積。結果表明，選取的10個共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3%，色譜圖在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”對主要色譜峰進行匹配，相似度在0.999以上，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性考察 精密稱取樣品G9，在“1.2.1”項下制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、18、24 h按“1.2.2”項條件下測定，記錄10個共有峰的保留時間和峰面積，并以咖啡堿為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積。結果表明選取的10個主要共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于5%，色譜圖在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”對主要色譜峰進行匹配，相似度在0.999以上，表示穩定性較好。

2.2.4 重復性考察 白茶樣品G9經粉碎后精密稱取6份，在“1.2.1”項下制備供試品溶液，按“1.2.2”項條件下測定，記錄10個共有峰的保留時間和峰面積，并以咖啡堿為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積。結果表明白茶色譜圖中選取的10個共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3%，色譜圖在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”對主要色譜峰進行匹配，相似度在0.999以上，表明重復性良好。

2.3 指紋圖譜的建立

將白茶樣品所得的色譜圖以AIA的格式依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”，以G9為參照峰，進行色譜圖疊加（圖7），選擇90%以上樣本中的共有峰為樣本的共有峰，在實驗中以保留時間為18.23 min的11號峰（咖啡堿）為參照峰確立了28個共有峰（圖8），各共有峰相對保留時間的RSD均小于2%，但各共有峰相對峰面積的值較大，說明不同品種、年份的白茶之間的差異較大（表4）。與對照品色譜圖對比，指認出6個峰分別是峰2：GA；峰7：EGC；峰11：CAF；峰13：EC；峰14：EGCG；峰21：ECG（圖8）。

圖7 12份茶葉樣品的HPLC指紋圖譜Fig.7 HPLCfingerprints of 12 tea samples

圖8 茶葉樣品對照色譜峰Fig.8 Chromatographic peaks of tea sample control

2.4 相似度分析

將12批白茶樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”相似度軟件，均值法生成指紋圖譜的對照圖譜。12批白茶樣品與對照圖譜的相似度在0.980～0.999之間，如表5，表明不同批次白茶成分組成一致，無顯著性差異。

表5 茶葉樣品的相似度Table 5 Similarity of tea samples

2.5 基于樣品28共有峰相對面積的聚類分析

如圖9所示，采用系統聚類分析法（HCA）對12批次白茶的數據進行分析，以峰11為參照峰計算28個峰的相對峰面積（見表4），將28個共有峰相對峰面積導入SPSS18.0軟件，觀察不同批次的白茶間的差異。聚類分析法采用組件均聯法，選用夾角余弦為刻度。結果表明，聚類分析將12個樣品分成了兩類，其中G1和G2為一類，其他10個樣品聚為一類。聚類分析表明各批次總體差異性較小，不同批次茶葉成分相對一致，差異較小，為白茶的研究奠定質量控制的基礎，便于白茶及白茶相關產品的研究。

圖9 12批茶葉樣品系統分析樹狀圖Fig.9 Dendrograms of cluster analysis on 12 batches of tea samples

表4 12批茶共有峰的相對峰面積Table 4 Relative area of common peaks in 12 batches of tea

3 結論與討論

本文建立了白茶HPLC指紋圖譜檢測方法，經對12批不同品種、不同年份白茶進行HPLC指紋圖譜研究，12批白茶樣品與對照指紋圖譜之間的相似度在0.98以上，說明12批白茶組成及含量基本一致，對圖譜中GA、CAF、EC、ECG、EGCG、EGC六個峰進行成分確認。該方法準確、可靠，可為白茶的質量控制和深度開發提供參考依據。研究之初，同時考察了壽眉的指紋圖譜，發現壽眉的某些兒茶素類成分如EGCG含量明顯低于其他三種白茶。故本指紋圖譜方法不適用于壽眉的鑒別。同時，本方法中共有峰多為茶多酚類物質，今后的研究中應關注到成分的廣譜性加以進一步的考察。

通過對12批白茶樣品相對峰面積的聚類分析中發現G1和G2在檢測中被分為一類，分別為2013年的牡丹王和2014年的白牡丹，其他10種被分為一類。同時觀察不同批次、種類白茶外觀的差異，年份越久遠白茶顏色越深，近幾年的白茶多為青綠色，陳年白茶多為棕褐色，與聚類分析的結果具有一定的相關性。筆者推測，茶葉中的茶多酚在存放過程中逐漸被氧化，使其中一些兒茶素類成分含量降低，生成茶黃素，故外觀相應發生變化。