正北芪多糖對結腸炎小鼠的抗炎作用研究

鐘 敏，李昕宇，郝佳美，任建武

（北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）危害性強，治療周期長，近年來歐美國家的IBD發病率相對穩定，而我國呈快速增長趨勢，預計2025年患病人數超過150萬人[1]。IBD包括克羅恩病（Crohn’s Disease，CD）和潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC），發病原因多為持續性腸道感染、腸粘膜屏障缺陷、免疫失調，也與遺傳因素及環境因素有關[2?3]，UC是炎癥性腸病的主要亞型之一，臨床癥狀主要表現為：腹痛、腹瀉、體重減輕、黏液血便等[4]。

多糖是黃芪的主要活性成分之一，在黃芪的不同藥材基源中，尤以產于我國山西省北部至內蒙古自治區中南部的正北芪多糖含量最高，療效最佳[5]，具有免疫調節、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗病毒、保護心血管、降血糖等多種藥理功效[6?8]。研究表明，黃芪多糖或者黃芪多糖與其他藥物組成的復方對UC均有治療作用。錢江等[9]研究發現黃芪與麥冬復合多糖可抑制促炎因子和刺激抗炎因子的釋放，對結腸炎有一定的改善作用。Yang等[10]采用TNBS誘導大鼠潰瘍性結腸炎模型，發現黃芪多糖可以通過調節TNF-α，IL-1β和NFATc4的表達，顯著改善實驗性大鼠結腸炎。但是黃芪多糖對UC的具體作用機制尚不明確，本研究用5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液建立小鼠潰瘍性結腸炎模型[11?12]，分析APS對結腸炎小鼠的治療效果，從而探究其對UC小鼠的可能作用機制，為進一步深入研究結腸炎的治療方法提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠 5～6周齡SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠，體重（20±1.5）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006；正北芪多糖（96.82%） 產自山西恒廣北芪生物科技股份有限公司的正北芪，前期實驗采用超聲輔助-水提法提取并經除雜分離純化后得到的純正北芪多糖；地塞米松（98%） 上海沃凱化學試劑有限公司；葡聚糖硫酸鈉（DSS，M.W.=50000） 上海源葉生物科技有限公司；SOD、MPO、NOS、MDA、NO測定試劑盒 南京建成科技有限公司；IL-6、IL-1β、D-LA、DAO、TNF-α血清細胞因子測定試劑盒 上海江萊生物科技有限公司。

新世紀T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；XMTD-6000恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司；TD5A臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；G50電動組織研磨器南京沃拓儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與干預 將50只5～6周齡，體重20.0±1.5 g的C57BL/6Cnc清潔級雄性小鼠適應性飼養1周后，隨機分為5組，即空白組、模型組（DSS組）、高濃度APS組、低濃度APS組、陽性對照組，小鼠的飼養、實驗和處死過程均遵照實驗動物管理條例和福利倫理指南執行。根據文獻[10,13]資料及預實驗效果，除空白組外，其他組別自由飲用5%DSS水溶液連續7 d，建立小鼠急性潰瘍性結腸炎模型，造模成功之后進行給藥治療一周，如表1。第14 d小鼠禁食16 h，但不禁水不禁藥，第15 d摘采集小鼠外周血，結腸標本備檢。

表1 試驗小鼠分組和給藥方案Table 1 Animal grouping and drug administration of experimental mice

1.2.2 指標檢測

1.2.2.1 小鼠疾病活動指數（DAI）評分 實驗過程中，每天觀察記錄小鼠的精神、體重、糞便、活動、飲食、存活等情況，并根據表2進行DAI評分[14]。

表2 DAI評分標準Table 2 DAI scoring criteria

1.2.2.2 小鼠結腸長度及病理組織學觀察 取肛門至回盲部的結腸，觀察記錄炎癥及潰瘍情況，并測量長度；取部分結腸組織用10%福爾馬林固定、常規石蠟包埋、連續4μm病理切片（HE染色），顯微鏡下觀察結腸黏膜損傷情況。

1.2.2.3 小鼠血清中D-LA、DAO、IL-6、IL-1β、TNF-α含量測定 第15 d摘小鼠眼球取血置于1.5 mL離心管中，3000 r/min離心15 min后取血清于?80℃凍存備用。血清中D-LA、DAO、IL-6、IL-1β、TNFα含量測定嚴格按照ELISA檢測試劑盒的說明操作進行。

1.2.2.4 小鼠結腸中MPO、SOD、NOS活性，以及MDA含量和NO水平檢測 取小鼠結腸組織稱重并剪碎，以冰生理鹽水作勻漿介質，利用勻漿器冰上勻漿成10%勻漿液，根據試劑盒的要求對MPO、SOD、NOS活性，以及MDA含量和NO水平進行檢測。

1.3 數據處理

采用SPSS23.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差（±s）表示，用Excel作相關數據處理和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 正北芪多糖對潰瘍性結腸炎小鼠DAI的影響

與空白組小鼠相比，經DSS誘導結腸炎的小鼠體重顯著降低，排便頻率增加，且糞便性狀松散或者含水，并粘有粘液和/或血液。由圖1可知，DSS組的DAI評分極顯著高于空白組（P<0.01），APS組、陽性對照組的DAI評分極顯著低于DSS組（P<0.01），所以APS可減輕DSS造成的潰瘍性結腸炎癥狀，具有改善作用。

圖1 潰瘍性結腸炎小鼠DAI評分Fig.1 Scoreof diseaseactivity index in micewith ulcerative colitis

2.2 正北芪多糖對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響

結腸長度是評價潰瘍性結腸炎的重要指標之一，本研究中空白組小鼠結腸長度最長（表3），與空白組相比，DSS組小鼠的結腸長度極顯著縮短（P<0.01）；與DSS組相比，高濃度APS組和陽性對照組小鼠的結腸均極顯著恢復（P<0.01），而低濃度APS組無顯著差異（P>0.05）。由此說明，高濃度正北芪多糖水溶液可顯著恢復潰瘍性結腸炎導致的小鼠結腸縮短。

表3 各組小鼠結腸長度及分析Table 3 Colon length and analysis of each group of mice

2.3 正北芪多糖對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理學的影響

HE染色小鼠結腸組織病理切片，光鏡下觀察，如圖2，空白組：結腸黏膜上皮完整，腺體連續，結構清晰，無炎癥和潰瘍，未見明顯病理改變。DSS組：結腸有大面積的潰瘍，黏膜水腫，上皮脫落，炎細胞浸潤明顯增多。高濃度APS組和陽性對照組：結腸恢復情況較好，潰瘍面積明顯縮小，組織水腫和充血顯著減輕，炎細胞浸潤明顯減少。低濃度APS組：結腸恢復效果不明顯。

圖2 各組小鼠結腸組織病理切片Fig.2 Pathological section of colon tissue of each group mice

2.4 正北芪多糖對潰瘍性結腸炎小鼠血清中D-LA、DAO水平的影響

D-LA和DAO水平分別是間接反應腸道黏膜通透性和上皮細胞是否完整的一項指標[15]，如圖3，DSS組小鼠血清中D-LA、DAO水平極顯著高于空白組（P<0.01），說明小鼠潰瘍性結腸炎造模成功。與DSS組相比，高濃度APS組和陽性對照組小鼠D-LA、DAO水平均顯著降低（P<0.05），低濃度APS組無顯著差異，藏凱宏等[16]發現黃芪多糖可劑量依賴性地降低潰瘍性結腸炎模型小鼠血清中D-LA和DAO水平，本研究中高濃度APS組治療效果明顯好于低濃度APS組，與前人研究一致，即APS能修復結腸炎大鼠腸道黏膜屏障及改善腸道上皮細胞的損傷。

圖3 各組小鼠血清中D-LA、DAO水平Fig.3 D-LA,DAOlevels in serum of each group mice

2.5 正北芪多糖對結腸炎小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α濃度和結腸組織中MPO的影響

當炎癥性腸病發生時，結腸組織中出現大量的炎癥細胞浸潤[17]，促炎因子的表達升高，如IL-6、TNF-α和IL-1β會大量釋放[18]，還有炎癥因子的介質MPO，它是炎癥反應的關鍵酶[19]，可誘導中性粒細胞及巨噬細胞產生自身炎癥反應，間接或直接促進炎癥因子的釋放，從而引起炎癥細胞向炎癥部位聚集，從而加重炎癥病情[20?21]。由圖4可以看出，DSS組小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度和MPO活力極顯著高于空白組（P<0.01），表明炎癥反應已發生。經APS和藥物干預后，高濃度APS組和陽性對照組的小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度和MPO活力顯著低于DSS組（P<0.05），低濃度APS組小鼠的小鼠血清中IL-1β、TNF-α的濃度無顯著差異，但IL-6極顯著降低（P<0.01）。并且上述病理切片顯示炎癥細胞浸潤明顯減少，腸道黏膜有一定程度的修復，由此說明高濃度APS可以降低細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度和MPO活力，降低潰瘍性結腸炎的炎癥反應，從而達到預防潰瘍性結腸炎的作用。

圖4 各組小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度及MPO活力Fig.4 Concentrations of IL-6,IL-1β,TNF-α and MPO activity each group mice

2.6 正北芪多糖對潰瘍性結腸炎小鼠SOD、NOS活力及MDA、NO水平的影響

炎癥性腸病發生時，NOS的表達增高，催化產生NO，導致NO含量增多[22]。體內過量的NO可以誘導某些炎癥細胞因子如IL-8，TNF-α和IL-1β的釋放[17]，NO還可與SOD的底物超氧陰離子迅速結合，產生具有強氧化作用的過氧亞硝酸鹽，參與炎癥性腸病的發病機制[23]。由圖5可以看出，DSS組小鼠結腸組織中的NOS活性、MDA含量和NO水平6極顯著高于空白組（P<0.01），但SOD活性極顯著降低（P<0.01）；各個給藥組的小鼠結腸組織中的NOS活性及MDA含量和NO水平顯著低于DSS組（P<0.05），高濃度APS組和陽性對照組的SOD活性顯著升高（P<0.05），低濃度APS組的SOD無顯著差異，表明高濃度APS對潰瘍性結腸炎有所改善，顯著提高患病小鼠抗氧化能力，從而直接或間接地減輕UC的炎癥反應。

圖5 各組小鼠結腸組織中SOD、NOS活力及MDA、NO水平Fig.5 Activity of SOD, NOS,MDA and NOin colon tissueof each group mice

3 討論與結論

近年來，炎癥性腸病的患病率逐漸上升，UC是較為常見的炎癥性腸病。臨床上治療以控制炎癥，抑制自身免疫反應，改善腸道黏膜屏障功能等措施為主[24]。本研究中APS組和陽性對照組的DAI評分極顯著低于模型組（P<0.01），高濃度APS組有效恢復了UC小鼠結腸長度和修復結腸組織，且從組織學的結果來看，高濃度APS水溶液與1μg·mL?1地塞米松水溶液療效相當，對UC小鼠具有一定的治療作用。

細胞因子在免疫調節和炎癥反應中起重要作用，UC小鼠血清中的促炎細胞因子水平較高，如IL-6、IL-1β、TNF-α等[25]，本研究發現經高濃度APS治療后，IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯減少，由此推測APS對UC的治療作用可能是通過減少Th1細胞的細胞因子數來實現的。APS具有明顯抗氧化作用，其對UC的修復作用主要通過降低組織MDA水平，提高SOD水平實現[26]。本研究進一步考察了NOS活性和NO含量，APS能極顯著降低NOS活性和NO含量（P<0.01），即APS能顯著提高患病小鼠結腸組織中的抗氧化能力，還有可能是通過降低NOS活性和NO含量，進而阻止過氧亞硝酸鹽的形成和細胞因子的釋放，從而減輕UC的炎癥反應，所以抑制NOS產生NO可能是治療UC的主要靶點之一[27]。

綜上所述，日常飲用0.7 mg·mL?1APS水溶液對UC小鼠具有顯著療效，其作用效果與抗氧化、改善腸道黏膜屏障功能、減少炎癥因子的釋放有關，但是APS對UC的作用機制具有多途徑、多靶點的特點[28]，后續有待進一步深入分析結腸組織內的蛋白質、mRNA以及其他臟器的指標，探究APS對UC的其明確的靶向作用機制。