人參寡肽抗苯并芘誘發肺上皮細胞炎性損傷研究

高 超，劉 杰，趙傳欣

（1.南方醫科大學第三附屬醫院藥劑科，廣東廣州 510000；2.深圳大學呼吸系統變態反應國家重點實驗室，廣東深圳 518060；3.東營市人民醫院科教科，山東東營 257000）

人參作為一種常用中藥，具有補脾益肺、扶正祛邪、補齊益智的功效，在韓國、中國和日本等國家被廣泛使用。人參富含生物活性成分，如人參皂苷、人參多糖、多肽和黃酮類化合物等[1]。研究發現人參皂苷是其主要有效成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌抗病毒等多種功效[2]。然而，人參肽類化合物的研究較少。寡肽是多肽的一種分類，一般由4～10個氨基酸組成，具有易于吸收的特點；現代研究發現，多種寡肽具有極強的生物活性，如免疫調節功能[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]等，因此寡肽是新藥研發的潛力股。

隨著大氣污染的加劇，哮喘、急性呼吸道感染和肺癌等疾病不斷發生。研究表明，長期暴露在空氣污染物中會增加哮喘的發病率[6]。化石燃料燃燒被認為是空氣污染中多環芳烴的主要來源[7]，其中苯并芘（Benzopyrene，Bap）是一種常見的致癌物，與哮喘等呼吸系統疾病的發病有著密切的關系[8]。芳香烴受體（Aromatic Hydrocarbon Receptor，AHR）是一種配體激活轉錄因子，被激活后AHR從細胞質轉運到細胞核，導致靶基因轉錄的改變（如CYP1A1、CYP1B1）和誘發免疫反應[9?10]。此外，AHR可通過調控炎癥細胞因子的表達進而影響免疫反應[11]。此外，氣道上皮細胞也可通過產生炎性細胞因子對環境刺激作出反應[12]，在哮喘的發生過程中發揮著關鍵作用[13]。核因子（NF-κB）在炎癥反應的基因調控和炎癥細胞因子轉錄調控中都起著重要作用[14]。如在LPS刺激的THP-1細胞中，c-Jun復合物與NF-κB蛋白p50/p65相互作用會協同增強TNF-α啟動子活性[15]。

基于此，本研究將分離人參中的寡肽類活性成分，治療由Bap導致的肺上皮細胞損傷，檢測肺上皮細胞中ROS的含量、線粒體膜電位的變化和細胞凋亡等指標，并研究其可能涉及的作用機制，為人參的功能性產品的開發甚至是寡肽新藥的研發提供新的思路和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮人參 深圳市凱聯健康生物技術有限公司（2019年11月，購買于吉林省通化市東昌區光明路11號同仁堂藥店，經暨南大學藥學院周光雄教授鑒定為（Panax ginsengC. A.Meyer）是五加科、人參屬多年生草本植物人參根）；IMDM、DMEM培養基和胎牛血清（FBS）Invitrogen（Termo Fisher Scientifc，MA，USA）；人肺上皮II型細胞（A549） 中國科學院細胞庫（上海）；ELISA試劑盒 碧云天生物科技有限公司（江蘇省碧云天生物技術研究所）；其他化學試劑 均為分析純。

Alliance MINIHD6多功能化學發光成像儀UVITEC公司；multiskan GO全波長酶標儀 賽默飛公司；CytoFLEX小型細胞信號分析儀 貝克曼公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參總蛋白的制備及寡肽的分離篩選

1.2.1.1 蛋白的提取 所有提取和分離步驟均在低于4℃條件下進行。將未做烘干處理的新鮮人參（2.0 kg）用榨汁機攪碎，100～200目篩過濾，濾液在2500 mL水/異丙醇（1:15 w/v）中攪拌4 h。隨后，抽濾，收集沉淀物（110 g）并溶解在0.20 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.3）中（5%，w/v）。離心（8000×g，15 min），收集上清液并冷凍干燥，作為總蛋白在?20℃下保存備用。

1.2.1.2 超濾分餾 以1 k Da分子量（MW）的超濾膜對所得總蛋白進行分離，獲得兩種肽組分RSO-A（MW≤1 k Da）和RSO-B（MW>1 k Da）。

疏水色譜：將RSO-A溶解于1.20 mol/L（NH4）2SO4中并上樣于緩沖液（0.20 mol/L PBS，pH7.3）平衡的Sepharose CL-4B疏水色譜柱（3.0 cm×90 cm）。以2.0 mL/min流速的（NH4）2SO4（1.20、0.60和0 mol/L）逐步洗脫。每50 mL收集并280 nm監測。共收集到10個組分，凍干，檢測其增強A549細胞抗Bap暴露導致細胞損傷的活性，收集活性最強的部分用于陰離子交換色譜。

1.2.1.3 陰離子交換色譜 將RSO-A-2溶液（3 mL，786 mg/mL）裝入去離子水預平衡的DEAE-52纖維素陰離子交換柱（2.5 cm×110 cm）中，用蒸餾水、0.10、0.60和1.20 mol/L （NH4）2SO4溶液以2.5 mL/min的流速洗脫，每60 mL收集洗脫液，280 nm監測。收集6個組分（RSO-A-2-1～RSO-A-2-6）凍干，檢測其增強A 549細胞抗Bap暴露導致的細胞損傷的活性，收集活性最強的部分用于凝膠過濾色譜。

1.2.1.4 凝膠過濾色譜 在Sephadex G-25柱（2.2 cm×110 cm）上以1.5 mL/min的流速對RSO-A-2-3溶液（2 mL，252 mg/mL）進行分餾。280 nm處收集并監測，收集4個組分（RSO-A-2-3-1～RSO-A-2-3-4）并冷凍干燥，檢測其增強A549細胞抗Bap暴露導致的細胞損傷的活性。收集活性最強的部分用于反相高效液相色譜（RP-HPLC）。

1.2.1.5 反相高效液相色譜 RSOA-2-3-3最終用RPHPLC（安捷倫1200-HPLC）分離。色譜柱為Zorbax，SB C-18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），洗脫溶劑體系由水/三氟乙酸（溶劑A；100:0.1，v/v）和乙腈/三氟乙酸（溶劑B；100:0.1，v/v）組成。流速：1.0 mL/min，梯度洗脫法（溶劑B 30%～80%），洗脫時間：60 min，檢測波長：280 nm，柱溫：20℃。RSO-1（tR 3.32 min）、RSO-2（tR 5.54 min）、RSO-3（tR 7.58 min）、RSO-4（tR 9.96 min）、RSO-5（tR 11.3 min）。HPLC法測定RSO-1～5的純度（>97.0%），RSO-1～5溶于PBS（10.0 mmol/L）。

1.2.2 細胞培養及活性測定A549細胞于DMEM培養基（10%FBS、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺）于37°C 5%的CO2培養箱中培養。A 549細胞（3×104細胞/孔）接種于96孔培養板中培養過夜。Bap（10 nmol/L）處理細胞3.0 h后，離心，棄上清液，細胞分別與RSO-1～5（20μmol/L）共培養12 h，CCK8檢測試劑盒檢測細胞活性。

1.2.3 活性氧（ROS）定及線粒體膜電位（ΔΨm）檢測5×105細胞/孔接種于6孔板中培養24 h，Bap（10 nmol/L）處理3.0 h后，離心，棄上清液，細胞換用新的培養基并加入RSO-1（10、50μmol/L）共培養12 h，ELISA試劑盒檢測ROS含量。

5×105細胞/孔接種于6孔板中培養24 h，Bap（10 nmol/L）處理3.0 h后，離心，棄上清液，細胞換用新的培養基并加入RSO-1（10、50 μmol/L）共培養12 h后，收集細胞，冷PBS洗滌，用1μg/mL JC-1在37℃黑暗中孵育30 min。流式細胞儀（BD-FACS-Calibur，Franklin Lakes，USA）分析ΔΨm變化情況。

1.2.4 細胞凋亡及Western blotting檢測5×105細胞/孔接種于6孔板中培養24 h，Bap（10 nmol/L）處理3.0 h后，離心棄上清液，細胞換用新的培養基并加入RSO-1（10、50μmol/L）共培養12 h，收集細胞用Annexin V-FITC/PI孵育，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

5×105細胞/孔接種于6孔板中培養24 h，Bap（10 nmol/L）處理3.0 h后，離心，棄上清液，細胞換用新的培養基并加入RSO-1（10、50μmol/L）共培養12 h，采集細胞總蛋白，參考文獻[16]方法測定相關蛋白表達變化情況。

1.3 數據處理

數據用means±SD表示；實驗數據使用SPSS19.0軟件或GraphPad Prism 5.1版軟件（GraphPad）進行進行統計處理；正態分布樣本的統計顯著性采用獨立的Studentt檢驗或方差分析進行評估；所有實驗重復3次，P<0.05在所有分析中被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 人參寡肽抗Bap誘導的A549細胞損傷作用

肽類化合物通常在ESI-MS/MS條件下質子化，由于在如此低的能量下很難打破側鏈的化學鍵，因此碎片大多發生在酰胺鍵上。因此，當碰撞能量小于200 ev時，b和y離子是主要的碎片離子[17]。將分離得到的人參寡肽用高效液相色譜-電噴霧質譜（HPLCESI-MS）對其氨基酸序列進行鑒定。以對RSO-1進行分子質量測定和肽結構表征（圖1）為例，離子片段m/z 546.2298為[M+H]+。離子片段m/z 417.1883為b4離子，m/z 382.1508為y4離子，m/z 324.1308為y3離子，m/z 306.1194為[y3-H2O+H]+離子。離子（m/z 278.1248）為[y3-COOH+H]+離子，m/z 195.0872為b3-b1離子，m/z 110.0705為典型片段[His-COOH+H]+。據此，推斷該肽的氨基酸序列為EGHGF。其余RSO-2～5氨基酸序列鑒定方式參考RSO-1，氨基酸序列見表1。

圖1 RSO-1結構及質譜圖Fig.1 Structure and mass spectrum of RSO-1

表1 RSO-1～5增強A549細胞抗Bap暴露導致的細胞損傷作用Table 1 RSO-1～5 enhance the effect of A549 cells against cell damage caused by Bap exposure

為了避免RSO寡肽本身可能存在的細胞毒性，檢測了RSO寡肽對A 549細胞活性的影響。此外，RSO-1～5對A 549細胞的細胞毒性實驗采用CCK8方法檢測，實驗結果顯示RSO-1～5在0～1.18 mmol/L（24 h）范圍內對A549細胞活性無影響。

研究發現，Bap暴露會誘發氧化應激、炎性因子分泌進而導致呼吸道上皮細胞損傷[18]。如表1所示，將正常對照組細胞活性設為100%，與正常對照組相比，Bap組細胞活力降低20.7%，說明Bap暴露使A 549細胞受到嚴重損傷。RSO-1～5處理提高了細胞活性，如經RSO-5使細胞活力提高了7.90%，而RSO-1組的細胞活力提高了13.0%（P<0.05），說明RSO-1具有增強A 549細胞抗Bap暴露誘導的氧化應激、炎性損傷的功能。

2.2 RSO-1增強A549細胞抗Bap暴露導致的細胞凋亡

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，細胞凋亡過程中會出現細胞收縮、核碎裂和染色質濃縮等細胞形態的特征性變化[19]。流式檢測結果顯示，與Control組相比，Bap組細胞總凋亡上升5.60%。而與Bap組相比，RSO-1（10、50μmol/L）治療組細胞總凋亡率分別降低2.77%和5.28%，說明RSO-1可增強細胞抗Bap誘導的細胞凋亡能力。細胞凋亡實驗為RSO-1抗Bap誘導A 549細胞損傷的保護作用提供了直觀的證據。

2.3 RSO-1減輕Bap暴露誘導的A549細胞氧化應激

自由基過量產生或抗氧化能力下降將導致DNA損傷并誘發細胞凋亡[20]。在炎癥細胞中，Bap可通過誘導活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）產生和線粒體膜電位（ΔΨm）降低，誘發氧化應激反應進而損傷細胞[21]。因此，可通過檢測細胞ROS變化情況以研究RSO-1是否能抑制Bap暴露誘導的細胞ROS產生，結果如圖3A所示。將正常對照組ROS含量設為1，與Control組相比，Bap組的ROS含量上升了2.73倍（P<0.05）。當RSO-1治療后，Bap誘導的ROS生成明顯減少。經不同濃度的RSO-1處理后，A549細胞中ROS含量分別下降31.6%（P<0.05）和56.8%（P<0.05）。

線粒體依賴通路在細胞受到氧化損傷時起著重要作用[22]。為探討RSO-1抗Bap誘導A549細胞氧化損傷的機制，檢測了細胞線粒體膜電位（ΔΨm）變化情況。如圖3A所示，Bap暴露使ΔΨm降低的A 549細胞比例從4.05%（對照組）下降到17.6%（P<0.05）。而經RSO-1處理后，ΔΨm下降的A549細胞比例分別減少了6.42%和11.7%。說明，RSO-1減少了細胞ROS的積累，減少了A549細胞的ΔΨm下降，說明RSO-1能減輕Bap暴露導致的A 549細胞氧化應激反應，保護細胞免受氧化損傷。

線粒體功能障礙會導致細胞色素c（Cytochrome C,Cyt c）從線粒體釋放到細胞質[23]。因此，用Western blotting方法檢測細胞質和線粒體Cyt c水平。結果表明，與Control組相比，Bap暴露導致細胞質Cyt c含量增加和線粒體Cyt c含量減少（圖3B）。然而，RSO-1處理逆轉了Bap暴露導致的細胞質和線粒體Cyt c的變化。

Trx系統在維持細胞氧化還原穩態中起著至關重要的作用[24]，鑒于Bap暴露會導致ΔΨm降低，ROS含量升高，進一步檢測A549細胞中Trx和TrxR的變化。如圖3B所示，Bap暴露導致Trx和TrxR的表達減少，而RSO-1使Trx和TrxR的表達均增加。

圖2 RSO-1抑制Bap暴露誘導的A549細胞凋亡Fig.2 RSO-1 inhibits A549 cell apoptosis induced by Bap exposure

圖3 RSO-1抑制Bap誘導的氧化應激反應Fig.3 RSO-1 inhibits Bap-induced oxidative stress

2.4 RSO-1對NF-κB和MAPKs信號通路的影響

NF-κB信號通路在許多炎癥性疾病中會被激活，可以調控TNF-α和IL-1β等炎癥介質的表達[25]。研究表明，巨噬細胞通過有絲分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPKs）和NF-κB信號途徑上調誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的表達，從而產生一氧化氮（Nitric Oxide, NO）[26]。因此，檢測了RSO-1是否通過MAPK和NF-κB信號途徑調控A 549細胞以抗Bap誘導的損傷。如圖4A所示，Bap暴露激活NFκB信號途徑相關蛋白的表達。而與Bap暴露不同，RSO-1作用后A 549細胞NF-κB信號通路的蛋白表達被抑制。如圖4A所示，50μmol/L RSO-1作用后顯著降低了A549細胞IκBα、IKKα及p65的磷酸化。

MAPKs與NF-κB信號通路類似，與Bap誘導的巨噬細胞炎癥介質調節有關。為進一步探討RSO-1抗Bap暴露誘導的炎性損傷機制，檢測了JNK和p38在Bap暴露及RSO-1干預后的表達變化情況。如圖4B所示，Bap使JNK和p38磷酸化表達增加并抑制了JNK和p38的表達，而RSO-1下調了JNK和p38的磷酸化，使JNK和p38的表達上升。推測RSO-1的保護作用是通過調節p38和JNK-MAPK，抑制NF-κB的活化發揮作用的。

圖4 RSO-1抑制Bap暴露誘導的NF-κB和MAPKs信號通路激活Fig.4 RSO-1 inhibits the activation of NF-κB and MAPKs signaling pathways induced by Bap exposure

2.5 RSO-1抑制Bap暴露誘導的AHR活化及AP-1因子的表達

激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）是調節細胞生存和死亡途徑關鍵的轉錄因子。AP-1是一種二聚體復合物，由原癌基因編碼的Jun家族和Fos家族蛋白質組成。AP-1是由堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine-zipper, bZIP）結構的Jun蛋白質（c-Jun、v-Jun、JunB和JunD）、Fos蛋白質（c-Fos、v-Fos、FosB、Fra1和Fra2）、激活轉錄因子（activating transcription factor，ATF，包括ATF2、ATF3/LRF1、B-ATF、JDP1和JDP2）和肌肉腱膜纖維肉瘤（musculoaponeurotic fibrosarcoma，MAF，包括C-Maf、Maf B、Maf A、Maf G/F/K和Nrl）家族形成高度保守的同源或異源二聚體，可激活下游靶基因的轉錄。作為啟動基因轉錄的分子開關，通過細胞應激刺激等各種條件調節基因的表達，參與增殖、凋亡、轉化和炎癥等多種細胞過程[27]。

因此，檢測了RSO-1對A 549細胞AP-1因子表達的影響，結果如圖5A所示。與Control組相比，Bap暴露使c-Jun、Jun-B、c-Fos和Fra-1表達增加298%、351%、252%和287%，而RSO-1處理降低了Bap暴露誘導的c-Jun、Jun-B、c-Fos和Fra-1表達。經50μmol/L RSO-1干預后，Bap暴露誘導的c-Jun、Jun-B、c-Fos和Fra-1表達分別下調46.2%、33.9%、49.4%和48.1%。據此推測，RSO-1抗Bap暴露誘導的炎性損傷作用可能是通過調控AP-1因子的表達發揮作用的。

圖5 RSO-1抑制Bap暴露誘導的AHR通路激活和AP-1因子表達Fig.5 RSO-1 inhibits AHR pathway activation and AP-1 factor expression induced by Bap exposure

AHR的激活在哮喘和炎癥性疾病的重要誘發因素[28]。為探討RSO-1對Bap暴露誘導A549細胞AHR活化的抑制作用，本研究檢測了AHR及其下游CYP1A 1蛋白的表達情況。結果如圖5B所示，Bap暴露使AHR表達顯著（P<0.05）增加；同樣，CYP1A1的表達也顯著增加。本研究表明RSO-1干預抑制AHR信號通路的激活。

3 討論與結論

研究顯示環境污染物苯并芘與哮喘等呼吸系統疾病的發病有著密切的關系[28]。人參作為傳統中藥已經使用歷史已達上千年，本課題研究了人參中含有的活性寡肽抗Bap暴露導致的人肺上皮細胞炎性損傷的活性及機制。

炎癥反應涉及多條信號通路，其中NF-κB是炎癥反應的中樞分子，是抗炎藥物的重要靶點[29]。研究發現，RSO-1可抑制暴露Bap誘導的IκBα、IKKα和p65磷酸化。AP-1復合物在調節炎癥和炎癥介質釋放中發揮著重要作用。Bap誘導了c-Jun、Jun-B、Fra-1和c-Fos的表達，而RSO-1抑制Bap暴露誘導的c-Jun、Jun-B、Fra-1和c-Fos的表達。據此推測AP-1可能是RSO-1的重要靶點。AHR是一種受體和轉錄因子，結果表明Bap暴露誘導AHR信號的激活，而經RSO-1干預后，Bap誘導AHR和CYP1A1在A 549中的表達顯著降低，提示AP-1和AHR可能在RSO-1的抗炎作用中起重要作用。推測RSO-1的抗炎作用是通過調節AP-1、NF-κB和AHR通路，抑制Bap誘發的氧化應激反應而發揮作用的。本研究的人參寡肽抗Bap誘發的肺上皮細胞炎性損傷的活性僅為細胞層面的體外實驗，實驗周期短、費用低，可以一次性檢測多種寡肽的抗炎活性，后續實驗可構建動物模型，針對一種或多種活性較好的寡肽進行深入研究。本文為人參功能性產品的進一步開發和抗炎新藥的開發提供理論基礎。