贊育丹對帕羅西汀誘導大鼠性功能障礙的治療作用及機制※

●劉巧斌 龔春水 張 榮 劉蘭蘭

隨著人們生活壓力的增加，焦慮和抑郁的發病越發普遍。5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs）可以抑制關鍵神經遞質5-羥色胺的攝取，是目前治療焦慮、抑郁癥的臨床常用藥[1]。然而臨床使用SSRIs治療男性患者時，常會導致性功能障礙等嚴重副作用的發生。研究發現，各種程度的性功能障礙在SSRIs 使用者中的發生率可以達到30%～80%[2]，其中，帕羅西汀引發性功能障礙的幾率最高[3]。性功能障礙嚴重影響患者的身體健康和生活質量，然而目前現代醫學對于SSRIs導致的性功能障礙并無有效的治療方式[4]。贊育丹出自《景岳全書·痿證論》，有補腎壯陽的功效，主治陽痿精衰、虛寒無子癥[5]。本次研究將明確贊育丹對帕羅西汀導致的性功能障礙大鼠的治療作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4月齡SPF級Wistar 大鼠，購自北京維通利華公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。雄性65 只，體重（150.2±15.1）g；雌性50 只，體重（142.3±16.2）g。環境溫度控制在（21.1±1.4）℃，12 h 的光照周期循環，自由飲食、飲水及活動，適應性喂養1 w。

1.2 實驗試劑黃體酮（國藥準字：H33020828，浙江仙琚制藥股份有限公司）；苯甲酸雌二醇（國藥準字：H31021297，上海通用藥業股份有限公司）；大鼠睪酮ELISA檢測試劑盒（Mybiosource 公司，貨號：MBS727352）；NO 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A012-1）；大鼠cGMP ELISA 檢測試劑盒（Mybiosource 公司，貨號：MBS282179）；抗eNOS 抗體（CST 公司，貨號：32027）；抗PDE5 抗體（Abcam 公司，貨號：ab28761）；抗GAPDH 抗體（CST 公司，貨號：5174）；羊抗兔IgG 抗體（CST 公司，貨號：#7074S）；兔抗羊IgG抗體（Abcam 公司，貨號：ab6741）；RIPA裂解液（碧云天公司，貨號：P0013B）；BCA定量蛋白檢測試劑盒（碧云天公司，貨號：P0012S）；PVDF 膜（millipore公司，貨號：IPVH00010）。

1.3 藥物配制贊育丹（白術、熟地各24 g，枸杞、當歸各18 g，肉蓯蓉、炒韭子、巴戟天、杜仲、山茱萸、仙茅、淫羊藿各12 g，蛇床子、制附子、肉桂各6 g）中各味藥材均購于南方醫科大學中藥房。將附子置于3000 mL 純水中浸泡30 min 后，先煎1 h，加入其余藥物再煎1 h 后，對藥液進行濃縮，定容至濃度為生藥3 g/mL，給藥前用蒸餾水稀釋為所需濃度。帕羅西汀片（國藥準字：H10950043，中美天津史克制藥公司）在研缽中磨為粉末，按10 mg/mL 濃度混懸于蒸餾水中配置而成，藥物均置于4 ℃冰箱保存備用。

1.4 動物篩選雌性SD 大鼠在性交配測試前48 h內注射苯甲酸雌二醇（10 μg/100 g）促使發情，前1 h注射黃體酮（0.5 mg/100 g）催情，對雄性大鼠進行性行為交配試驗測試[6]。選擇30 min 內完成射精性行為≥3次的雄性大鼠共50只進行后續實驗。

1.5 分組及給藥50 只雄性大鼠隨機分為5 組，每組10只，分別為正常組（予等體積生理鹽水）、模型組（予帕羅西汀10 mg/kg）、贊育丹低劑量組（予帕羅西汀10 mg/kg及贊育丹10.7 g/kg）、贊育丹中劑量組（予帕羅西汀10 mg/kg 及贊育丹21.4 g/kg）、贊育丹高劑量組（予帕羅西汀10 mg/kg及贊育丹42.8 g/kg），每天1次，連續灌胃4 w。

1.6 性行為參數雄性大鼠的實驗交配行為由經過統一培訓的2名觀察者記錄，減少主觀誤差。雄性大鼠末次灌胃結束后1 h，單獨被放置在一個50 cm ×30 cm × 20 cm 的玻璃暗光觀察室內，適應5 min 后放入發情的雌性大鼠，統計各組雄性大鼠在30 min內的性行為相關參數。包括：①騎跨潛伏期（ML）：與雌鼠同籠開始至第1次騎跨所需時間；②插入潛伏期（IL）：與雌鼠同籠開始至第1次插入陰道所需時間；③騎跨次數（MF）：從首次騎跨雌鼠到射精前進行的騎跨次數；④插入次數（IF）：射精前插入陰道的次數；⑤射精潛伏期（EL）：首次插入到射精所需時間[7]。

性行為參數檢測結束后第二天，乙醚麻醉后，腹主動脈取血，離心分離血清；并在冰皿上快速分離陰莖，用生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心取上清液，-20 ℃保存待測。

1.7 血清睪酮測試采用ELISA法進行檢測。

1.8 陰莖組織中cGMP、NO水平檢測陰莖組織勻漿上清液經適當稀釋后采用ELISA 法檢測cGMP 水平，按NO檢測試劑盒說明書檢測NO水平。

1.9 陰莖組織中eNOS、PDE5 水平檢測取50 mg陰莖組織加入液氮研磨成粉末，加入適量的RIPA 裂解液裂解細胞，離心，取上清，BCA 法定量蛋白。取20 μg 總蛋白加入5×上樣緩沖液，100 ℃、5 min 變性，10%的SDS-PAGE 電泳，半干電轉法將蛋白質轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h 后，一抗（eNOS 1:1000、PDE5 1:1000、GAPDH 1:1000）孵育過夜，PBS洗三遍，二抗（1:1000）孵育1 h，ECL化學發光法檢測蛋白條帶，用GAPDH蛋白條帶作為內參。

1.10 統計學處理數據采用均數±標準差()表示，采用SPSS16.0 軟件進行分析。One Way ANOVA法檢測組間差異，方差齊的采用LSD 進行兩兩比較，方差不齊的采用Dunnetts T3進行兩兩比較。

2 結果

2.1 對帕羅西汀誘導性功能障礙的影響與正常組相比，模型組的ML、IL 以及EL 顯著增加，MF 和IF 顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組相比，贊育丹低、中、高劑量組的ML、IL 以及EL 隨著贊育丹劑量的升高而顯著降低，MF 隨著贊育丹劑量的升高而顯著增加，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。IF 隨贊育丹劑量的升高而有增加的趨勢，其中贊育丹中、高劑量組與模型組相比有統計學差異（P<0.05或P<0.01）。見表1。

表1 贊育丹對帕羅西汀誘導性功能障礙的影響（-x± s，n=10）

2.2 對血清睪酮的影響與正常組相比，模型組大鼠血清的睪酮含量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）；經過不同劑量的贊育丹給藥治療后，睪酮含量隨著贊育丹給藥劑量的增加而增加，與模型組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。見表2。

表2 贊育丹對血清睪酮的影響（-x± s，n=10）

2.3 對大鼠陰莖NO、cGMP含量的影響與正常組相比，模型組大鼠陰莖NO、cGMP含量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。經過贊育丹給藥治療后，NO、cGMP含量均顯著增加，且呈劑量依賴性，與模型組比較均具有統計學差異（P<0.01）。見表3。

表3 贊育丹對大鼠陰莖cGMP、NO含量的影響（-x± s，n=10）

2.4 對大鼠陰莖eNOS、PDE5 含量的影響模型組大鼠eNOS含量較正常組降低，差異有統計學意義（P<0.01）；經過贊育丹給藥治療后，eNOS 含量均顯著增加，且呈劑量依賴性，與模型組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖1A、B。

模型組大鼠PDE5 較正常組升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，贊育丹中、高劑量組PDE5含量均顯著降低，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義（P<0.01），低劑量組的PDE5 含量與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1A、C。

圖1 贊育丹對大鼠陰莖eNOS、PDE5含量的影響

3 討論

5-羥色胺（5-HT）是人體重要的神經遞質，影響大腦活動各個方面，參與調節睡眠、痛覺及快感等生理過程。SSRIs 作為常用的抗抑郁藥物，可以抑制5-HT的釋放、合成，具有療效可靠、不良反應少等優點，卻容易導致男性患者發生性功能障礙，其可能的機制包括：SSRIs 可以通過激活5-HT2 受體來抑制多巴胺的釋放，導致催乳素的脫抑制性升高，從而導致性欲降低，使性喚醒的閾值增加；SSRIs也可以抑制副交感神經乙酰膽堿的釋放，引起陰莖勃起功能障礙；SSRIs抑制NO 的合成，NO 是陰莖勃起的重要信號傳導物質，抑制NO的合成會導致性功能障礙的發生[8]。

目前，對于由SSRIs引起的性功能障礙，缺少有效的解決辦法，臨床處理措施為停用該藥物。近年來發現坦度螺酮對于SSRIs引起的性功能障礙具有一定的治療作用[9]，但卻會導致頭暈、嗜睡、失眠、頭痛等嚴重副作用[3]。中醫藥具有療效顯著、副作用小等特點，為藥物治療由SSRIs引起的性功能障礙提供新的研究思路和方向。性功能障礙的中醫治療以補腎、疏肝為主[10]。贊育丹具有補腎壯陽之效，為臨床常用方。臨床研究表明，贊育丹可以有效治療弱精患者[11]；動物實驗也發現贊育丹可以通過增加精子數量、修復受損組織來改善性功能障礙大鼠的癥狀[12]。本次研究采用帕羅西汀誘導大鼠性功能障礙，結果發現，贊育丹可以顯著降低模型大鼠的ML、IL以及EL，增加MF，表明贊育丹具有治療帕羅西汀誘導性功能障礙的作用。

性功能障礙的臨床表現主要有早射、無法勃起、射精沒力、勃起不堅等，其中以陰莖勃起功能障礙為最常見的癥狀[13]。海綿體內神經末梢及海綿竇內皮細胞在eNOS酶的作用下合成并釋放NO，增高海綿體平滑肌中cGMP的水平，下調細胞鈣離子濃度，導致陰莖海綿體血管平滑肌舒張，大量血流進入海綿體組織，從而導致海綿體內壓升高完成勃起過程[14]。PDE5是磷酸二酯酶家族的一員，在陰莖中主要的磷酸二酯酶亞型，能特異性抑制cGMP 的活性。因此，抑制PDE5、提高cGMP是勃起功能障礙的主要治療策略之一[15]。本研究發現贊育丹可以提高陰莖組織中NO、cGMP、eNOS 的含量，降低陰莖組織中PDE5 的含量，表明贊育丹可以通過調控NO/cGMP途徑改善勃起功能障礙。調控NO/cGMP 途徑是中藥防治勃起功能障礙的研究熱點[16]。淫羊藿是贊育丹的有效組成之一，有研究發現淫羊藿能抑制PDE5的活性改善勃起功能障礙[17]。因此，筆者推測淫羊藿是贊育丹中抑制PDE5，防治勃起功能障礙的主要藥物。

睪酮作為一種雄激素，對于男性性特征發育、精子發育、性器官發育、性沖動的產生等方面起著重要作用，維持高水平的血清睪酮含量是提高性欲的基礎[18]。研究發現，30%～35%對PDE5 抑制劑無效的勃起功能障礙患者與低水平血清睪酮相關，聯合使用睪酮與PDE5抑制劑有更好的治療效果[19]。本研究發現贊育丹可以顯著增加帕羅西汀誘導性功能障礙模型大鼠血清中睪酮的含量，提示贊育丹改善帕羅西汀誘導性功能障礙的機制可能與提高睪酮相關。贊育丹中多種中藥成分，如仙茅[20]、淫羊藿[21]、巴戟天[22]，都具有提高睪酮的作用。本研究提示，贊育丹可能通過提高睪酮及抑制PDE5雙重作用改善勃起功能障礙。

本研究表明，贊育丹可能通過調控NO/cGMP 途徑、提高睪酮及抑制PDE5，從而改善SSRIs 引起的性功能障礙。本研究也提示贊育丹具有治療其它原因導致的性功能障礙的可能，可在后續研究中進一步探討。此外，大量研究證實PDE5介導的NO/cGMP途徑還在心血管疾病中起重要作用[23-24]，提示贊育丹可能可以在心血管疾病中有一定的應用前景，值得探索。