超高效液相色譜法測定激素性股骨頭壞死患者血漿中甲潑尼龍質量濃度*

張麗藏，張 霞，劉 劍，張志清△，董維沖，范欣欣

（1. 河北醫科大學第二醫院藥學部，河北 石家莊 050000； 2. 河北醫科大學藥學院，河北 石家莊 050017）

甲潑尼龍屬中效糖皮質激素，大量或長期使用可導致股骨頭無菌性壞死、骨質疏松、高血壓、高血糖等不良反應[1－2]。糖皮質激素可導致非創傷性股骨頭壞死(又稱激素性股骨頭壞死)。遺傳易感等個體差異也可能是股骨頭壞死的原因之一。研究發現，PA－1 基因的4G／5G 基因型發生股骨頭壞死的風險高，5G 型風險最低。ABCB1 基因型的3435C 發生股骨頭壞死的風險比3535T 高2 ～3 倍[3]。通過探討基因測序結果與患者體內甲潑尼龍血藥濃度的相關性建立測定甲潑尼龍血藥濃度的方法尤為重要。本研究中建立了測定血漿中甲潑尼龍質量濃度的超高效液相色譜(UPLC)法，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；R18 型高速離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；XW－80A 型渦旋混合儀（上海醫科大學儀器廠）；KL512J 型恒溫水浴氮吹儀（北京康林科技有限公司）；CPA225D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；MDF－U2086S 型低溫冰箱（日本Sanyo 公司）；KQ－300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲潑尼龍對照品（批號為100828－201603，含量為99.8%），地塞米松對照品（批號為100129－201506，含量為99.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；三氯甲烷為分析純；高純度氮氣（石家莊京聯實用氣體有限公司，批號為20171110）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BSH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈－水（29 ∶71，V／ V）；流速：1 mL／min；檢測波長：242 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

稱取甲潑尼龍對照品100 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度為1 mg／mL的甲潑尼龍對照品溶液，4 ℃冷藏，待用。稱取地塞米松（內標）對照品100 mg，同法制備成質量濃度為1 mg／mL的內標溶液。取適量，用甲醇制得質量濃度為1 μg／mL 的工作液，置－40 ℃保存。采集患者清晨空白血漿，備用。

2.3 血漿樣品及質控樣品制備

取2.2 項下甲潑尼龍對照品溶液適量，用甲醇稀釋成質量濃度分別為0.125，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 μg ／ mL 的系列對照品溶液，置4 ℃保存。分別取20 μL，置10 mL 試管中，40°C 水浴下氮氣吹干，加入空白血漿，制得系列對照品模擬血漿樣品。制備0.3，0.8，2.4 μg／mL 對照品模擬血漿樣品、對照品和內標的模擬血漿樣品。

2.4 血漿樣品處理

取血漿樣品200 μL，置10 mL 試管中，加入地塞米松內標液20 μL，渦旋，加入三氯甲烷5 mL，渦旋2 min混勻，靜置10 min。取下層有機相（含藥三氯甲烷）4 mL置5 mL 離心管中。40 ℃水浴下氮氣吹干，殘渣用100 μL甲醇復溶，取80 μL 置進樣小瓶中，備用。空白血漿處理同上。

2.5 方法學考察

專屬性考察：取空白血漿及對照品和內標的模擬血漿樣品，按2.4 項下方法處理，按2.1 項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1?？梢姡搜獫{中甲潑尼龍的分析不受空白血漿樣品內源性物質的干擾，甲潑尼龍和內標的保留時間分別為3.69，4.28 min，兩峰分離較好。

圖1 超高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系與檢測限、定量限考察：分別取2.3 項下系列對照品模擬血漿樣品，按2.4 項下方法處理，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以甲潑尼龍質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、甲潑尼龍與內標峰面積比值( Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝1.106 2 X－0.076 8（R2＝0.998 4，n ＝7）。結果表明，甲潑尼龍質量濃度在0.125 ～3.0 μg／mL 范圍內與相對峰面積線性關系良好。以信噪比（S／ N）為3 ∶1 和10 ∶1 計算得血漿中甲潑尼龍的檢測限和定量限分別為0.05 μg／mL和0.125 μg／mL。

回收率試驗：取2.3 項下低、中、高質量濃度的對照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項下方法處理，按2.1項下色譜條件進樣測定，以實測濃度與理論濃度的比值作為方法回收率。取低、中、高質量濃度的對照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項下方法處理，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄甲潑尼龍和內標及甲潑尼龍對照品峰面積。以待測物及對應對照品峰面積的比值計算提取回收率。結果見表1。

表1 血漿中甲潑尼龍的回收率試驗結果（%，n ＝5）Tab.1 Results of the recovery test of methylprednisolone in plasma（%，n ＝5）

精密度試驗：取2.3 項下低、中、高質量濃度的對照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項下方法處理，按2.1項下色譜條件進樣測定于1 d 內測定，按標準曲線求得甲潑尼龍的實際濃度，計算日內精密度。連續3 d 同法測定，計算日間精密度。結果見表2。

表2 血漿中甲潑尼龍的日內、日間精密度試驗結果（n ＝5）Tab.2 Results of the intra－day and inter－day precision test of methylprednisolone in plasma（n ＝5）

穩定性試驗：取2.3 項下低、中、高質量濃度的對照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項下方法處理，室溫下放置0，2，4，6，8 h 后按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算甲潑尼龍的血藥濃度。結果的RSD 不超過4.30%（n ＝5），詳見表3，表明室溫下對照品模擬血漿樣品放置8 h 穩定。取2.3 項下低、中、高質量濃度的甲潑尼龍模擬血漿樣品，各5 份，反復凍融3 次，按2.4 項下方法處理，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算甲潑尼龍質量濃度。結果的RSD 均不超過4.00% （n ＝5），詳見表4，表明對照品模擬血漿樣品反復凍融3 次后仍穩定。同前文“反復凍融3 次”及按2.4 項下方法處理血樣冰凍7 d，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算甲潑尼龍質量濃度。結果的RSD 均不超過3.70%（n ＝5），詳見表4，表明對照品模擬血漿樣品冰凍7 d 后穩定性較好。

表3 室溫放置8 h 的穩定性試驗結果（n ＝5）Tab.3 Results of the stability test of methylprednisolone in plasma at room temperature within 8 h（n ＝5）

表4 反復凍融3 次、冰凍7 d 的穩定性試驗結果（n ＝5）Tab.4 Results of the stability test of methylprednisolone in plasma after three repeated freeze－thaw cycles and 7－day freezing（n ＝5）

3 討論

對于樣品的處理，預試驗中嘗試了分別以乙腈－水、乙腈－甲酸銨水溶液、乙腈－甲酸水溶液為流動相。但觀察到，在水相中加入甲酸銨鹽會使出峰時間提前，但會升高柱壓，峰形無明顯變化，出于對色譜柱及經濟環?？紤]，故選擇乙腈－水作為流動相。血漿樣品處理常用蛋白沉淀法和液－液萃取法，由于UPLC 儀對樣品純度要求極高，故試驗中采用液－液萃取法。預試驗中曾采用乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、氯仿進行萃取，結果發現用氯仿萃取效果最好，樣品分離度最高，峰形最好，故選擇氯仿萃取。甲潑尼龍又稱甲潑尼龍琥珀酸鈉，為人工合成的中效糖皮質激素，臨床主要用于抗炎、免疫抑制、抗休克和抗過敏，還可通過聯合用藥達到治療目的[4]。其作用機制包括減輕脂質過氧化反應，減少體內自由基，甲潑尼龍可穿過細胞膜，阻止核因子（NF）－κB 等轉錄因子的通路影響蛋白的轉錄[5]。在激素性股骨頭壞死的研究中發現，激素的使用劑量與壞死范圍和風險相關。此外，糖皮質激素受體的多樣性可能也是導致股骨頭壞死個體差異的一種因素[6－10]。miRNA 是一類內源的、基因編碼長度為20 ～24 個核苷酸的小分子RNA，細胞的許多生理功能受其調節，它在激素性股骨頭壞死中有顯著作用，試驗證實，激素尤其是中效激素甲潑尼龍干預后，miR－672－5pd 在大鼠成骨細胞的表達量最大，與此同時骨壞死的風險隨之增加[11－12]。既往的文獻多采用高效液相色譜法或氣相色譜串聯質譜法測定甲潑尼龍血藥濃度[13－14]，考慮到樣品量及經濟成本，本研究中建立了快速、高效的UPLC 法測定血漿中甲潑尼龍的質量濃度，擬用此方法測量使用甲潑尼龍患者的血藥濃度，以更好地預防藥品不良反應，為臨床用藥提供試驗依據。本研究不足之處在于，僅建立了相關測定方法及進行了方法學考察，并未對患者的真實血樣進行測定。后續需就此開展進一步研究。