人類白細(xì)胞抗原基因多態(tài)性與服用氯氮平患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性研究*

王姝姍，曲，朱浩浩，張忠東

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫精神衛(wèi)生中心藥學(xué)部，江蘇 無錫 214151）

氯氮平為非典型抗精神分裂癥藥物，能顯著改善病程和預(yù)后，并對(duì)難治性精神分裂癥有效[1]。因其使用過程中會(huì)引起白細(xì)胞減少癥（LP）和嚴(yán)重的粒細(xì)胞缺乏癥（發(fā)生率約為1%），并不作為首選藥物[2－3]。以往通過監(jiān)測(cè)血藥濃度協(xié)助臨床調(diào)整藥物劑量[4－5]，近年來關(guān)于基因多態(tài)性和血藥濃度潛在的相互關(guān)聯(lián)與LP 的差異分析成為研究熱點(diǎn)。有研究表明，人類白細(xì)胞抗原基因( HLA－ B)差異是氯氮平導(dǎo)致LP 個(gè)體差異的重要原因之一[6]，可從此著手減少不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究中探討了HLA－ B*57 ∶01[分為野生(G／G)型和雜合(G／A)型]、HLA－B*35∶08[分為野生(G／G)型、雜合(G ／A)型、突變(A ／A)型]基因多態(tài)性與精神分裂癥患者氯氮平用藥治療過程中血藥濃度和LP 的相關(guān)性，為減少不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及安全用藥提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取醫(yī)院2018 年至2019 年收治的精神分裂癥患者，年齡18 ～65 歲；漢族；符合第10 版國際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)（ICD－10）關(guān)于精神分裂癥的診斷（F20）；以氯氮平為主要治療藥物，白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）為(4 ～10) ×109L－1。排除嚴(yán)重軀體疾病、妊娠婦女，以及氯氮平治療前已存在外周血白細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和／或粒細(xì)胞絕對(duì)值異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 方法

用藥情況統(tǒng)計(jì)：統(tǒng)計(jì)患者使用氯氮平治療精神分裂癥的實(shí)際劑量，首次劑量為25 ～75 mg／d，逐漸緩慢增加至常用劑量200 ～400 mg／d，最高可達(dá)600 mg／d。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)可調(diào)整為25 ～600 mg／d，調(diào)整間隔不短于24 h。

血藥濃度監(jiān)測(cè)：患者使用氯氮平需5 ～7 個(gè)消除半衰期后達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。約9 ～10 d（±1 d）后，末次服藥15 ～45 min 前，采集外周靜脈血4 mL，置乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，離心，分離得血漿，－20 ℃保存。采用FLC－2701 型全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀（長沙安萊科分析儀器有限公司），第一維色譜系統(tǒng)（LC1）主要負(fù)責(zé)樣品在線富集及第一維初步分離，第二維色譜系統(tǒng)（LC2）主要負(fù)責(zé)進(jìn)一步分離檢測(cè)。第一維色譜柱為Aston SX1 柱（25 mm × 4.6 mm，5 μm），流 動(dòng) 相 為10 mmol／L 磷酸二氫銨－乙腈－甲醇（92 ∶6 ∶2，V／ V／ V，pH 3.5），流速為1.0 mL／min，中間柱為Aston SCB 柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；第二維色譜柱為Aston SCB柱（100 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為20 mmol／L 磷酸二氫銨－乙腈－甲醇（50 ∶30 ∶20，V／ V／ V，pH 3.0），流速為1.2 mL／min，進(jìn)樣量為200 μL，柱溫為40 ℃。紫外吸收波長channel 1 為262 nm，channel 2 為290 nm。氯氮平血藥濃度測(cè)定，考察線性范圍，結(jié)果線性范圍為0 ～1 105.2 ng／mL( R2＝0.999 9)。計(jì)算單位劑量血藥濃度（血藥濃度－劑量比）。

HLA 基因檢測(cè)：采用多重SNaPShot 檢測(cè)方法檢測(cè)HLA－ B 基因位點(diǎn)，測(cè)序分型首先需通過多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增得到包含所研究SNP 位點(diǎn)的DNA 片段，采用3730XL 型基因測(cè)序儀（美國ABI 公司）檢測(cè)HLA－B*57∶01、HLA－B*35∶08基因多態(tài)性，上游引物分別為5′－TGTTCAGTGGCTCCGAGCACA－3′和5′－CTCTTAGCAATTGTACCCATC－3′，下游引物分別為5′－GGCCAGAGAGGCTGCCACATG－3′和5－TAGTAAGCAGTAGGGAGTAAC－3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共入組150 例患者，其中男65 例，女85 例；平均年齡（46.07±10.22）歲；穩(wěn)態(tài)時(shí)氯氮平穩(wěn)態(tài)血藥濃度為（415.39±10.95）ng／mL，其中女性較男性高，與楊淑珍等[7]的研究結(jié)果一致。詳見表1。

表1 患者一般資料（± s）Tab.1 General data of patients（± s）

表1 患者一般資料（± s）Tab.1 General data of patients（± s）

注：與女性比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those of female，*P ＜0.05.

項(xiàng)目年齡(歲)發(fā)病年齡(歲)氯氮平穩(wěn)態(tài)血藥濃度（ng／mL）男性（n ＝65）45.91±12.75 28.40±11.60 311.04±6.38*女性（n ＝85）46.44±11.38 30.31±12.07 454.21±12.64合計(jì)（n ＝150）46.07±10.22 29.32±10.30 415.39±10.95

2.2 服藥劑量對(duì)血藥濃度的影響

結(jié)果見表2?？梢姡貌煌談┝柯鹊降幕颊哐帩舛龋瓌┝勘葻o顯著差異（P ＞0.05）。

表2 不同日劑量氯氮平患者的血藥濃度Tab.2 Plasma concentration of patients treated with different daily doses of clozapine

2.3 基因型對(duì)氯氮平血藥濃度及WBC 的影響

HLA－B*57∶01基因中，G／G 型與G／A 型患者氯氮平血藥濃度和WBC 均無顯著差異（P ＞0.05）。HLA－B*35∶08基因中，3 型患者氯氮平血藥濃度無顯著差異（P ＞0.05），但A／A 型患者的WBC 顯著低于G／G 型和G／A 型（P ＜0.05）。詳見表3。

表3 不同基因型患者的氯氮平血藥濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)（± s）Tab.3 Plasma concentration of clozapine and WBC of patients with different genotypes（± s）

表3 不同基因型患者的氯氮平血藥濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)（± s）Tab.3 Plasma concentration of clozapine and WBC of patients with different genotypes（± s）

基因型HLA－B*57 ∶01 G／G 型（n ＝96）G／A 型（n ＝54）P 值HLA－B*35 ∶08 G／G 型（n ＝74）G／A 型（n ＝53）A／A 型（n ＝23）P 值血藥濃度（ng／mL）318.67±11.93 347.17±4.64 0.563 329.46±13.66 377.74±4.98 364.28±1.90 0.052白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109 L－1）4.65 ±0.34 4.53 ±0.52 0.674 4.27 ±0.63 4.55 ±0.72 3.77 ±0.24 0.043

3 討論

藥物致白細(xì)胞減少主要有2 種機(jī)制，一種是藥物選擇性對(duì)骨髓造血系統(tǒng)的白細(xì)胞有直接的、呈量效關(guān)系的毒性作用，可抑制粒細(xì)胞形成；另一種是遲發(fā)性反應(yīng)，這可能是抗體介導(dǎo)的特異性、與劑量無關(guān)的、免疫源性的特異質(zhì)反應(yīng)[8－9]。本研究中，HLA－B*57∶01和HLAB*35∶08不同基因型間氯氮平血藥濃度無顯著差異，但HLA－B*35∶08（P ＜0.05）A／A 型患者的WBC 顯著小于G／A 型和G／G 型，顯示出免疫介導(dǎo)的特異性。WICISKI 等[10]的研究表明，尚未代謝的氯氮平被白細(xì)胞吸收，并通過氧化過程轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)凋亡的代謝物。目前的理論認(rèn)為，活性氧－硝酸根離子是引起LP 的最重要因素，有自身免疫的背景，而不是毒性[10]。

HLA－B*57∶01和HLA－B*35∶08不同基因型間氯氮平血藥濃度無顯著差異，提示氯氮平血藥濃度在治療范圍內(nèi)，但LP 患者可能存在白細(xì)胞中氯氮平血藥濃度升高。

BERGEMANN 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，LP 患者（1 例）白細(xì)胞中的氯氮平濃度約為接受氯氮平治療患者（10 例，無嚴(yán)重不良反應(yīng)）的8 倍，而氯氮平的血藥濃度無顯著差異。但該研究缺少對(duì)于HLA 的分析。本研究中并未檢測(cè)白細(xì)胞內(nèi)氯氮平濃度的差異，更未將這種差異與2 種基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，是本研究存在不足之處，需擴(kuò)大樣本量和改進(jìn)分析設(shè)備。

HLA－B*57∶01和HLA－B*35∶08多態(tài)性主要與抗原結(jié)合裂縫有關(guān)，從而使HLA 同種異型所選擇的自源性和病原體源性多肽抗原的種類多樣化。部分研究強(qiáng)調(diào)了HLA 多態(tài)性在藥物基因組學(xué)中的重要性，并為涉及小分子藥物的HLA 連鎖超敏反應(yīng)提供機(jī)制分析[12－13]。在中國人群中，HLA－ A、－ B、－ C、－ DRB1 和－ DQB1 位點(diǎn)共有676 個(gè)等位基因被成功定義，包括159 個(gè)常見等位基因和517 個(gè)有文獻(xiàn)記載的等位基因[14]。由于其多基因特性的復(fù)雜化，難具有普遍性，以至于開發(fā)具有高特異性和高靈敏度的臨床預(yù)測(cè)性的基因產(chǎn)品困難重重[15]。

綜上所述，HLA－B*57∶01和HLA－B*35∶08不同基因型引起WBC 不同程度減少，提示了LP 的HLA基因的免疫源性原因，為降低用藥風(fēng)險(xiǎn)，提高用藥的安全性提供了參考。但HLA 過于復(fù)雜的多基因特性，可能會(huì)阻礙開發(fā)具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的基因檢測(cè)產(chǎn)品。