超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定中成藥中馬兜鈴酸Ⅰ含量*

周春玲，劉天竹，李曉欣，康 強，李成森，赫愛平

（遼寧省檢驗檢測認證中心·遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110036）

馬兜鈴科Aristolochiaceae 馬兜鈴屬Aristolochia L.植物具有廣泛的藥用價值，其所含的馬兜鈴酸類成分具有抗感染、抗腫瘤活性及增強吞噬細胞活性的作用。20 世紀80 年代起，有研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸具有很強的腎毒性和致基因突變作用[1－4]。歐洲發(fā)現(xiàn)了因服用含馬兜鈴酸中藥致腎衰竭的病例，美英等國先后禁止使用含馬兜鈴酸的原料和制品，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局先后取消了青木香、廣防己和關(guān)木通的標準，并要求對含馬兜鈴的中藥制劑嚴格按處方藥管理。我國馬兜鈴科植物有46 種，處方中含馬兜鈴屬藥材的中成藥口服制劑有43 種，雖然許多研究中都測定了中藥材中馬兜鈴酸的含量，但目前尚無關(guān)于含馬兜鈴植物的中成藥的報道，現(xiàn)行中成藥標準均無控制馬兜鈴酸含量的標準。馬兜鈴酸Ⅰ為馬兜鈴酸類化合物的主要毒性成分[5－10]，目前對于馬兜鈴酸類化合物的測定主要采用高效液相色譜（HPLC）法[11－15]。由于中成藥所含藥味較多，成分復(fù)雜，且馬兜鈴酸Ⅰ的含量較低，故本研究中采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定中成藥中馬兜鈴酸Ⅰ的含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity 型超高效液相色譜儀、Xevo TQ－S 型質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；Auto Science 10200AD 型超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；BSA 224SCW 型電子天平（德國Sartorius 公司）。

1.2 試藥

13 種58 批樣品（市售）；馬兜鈴酸Ⅰ對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110746－201611，含量為98.9%）；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸（含10 mmol／L 甲酸銨，A）－乙腈（B），梯度洗脫（0 ～4 min 時50%A，4 ～7 min 時10%A，7 ～10 min 時50%A）；流速：0.3 mL／ min；柱溫：25 ℃；進樣量：1.0 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；干燥氣：氮氣；毛細管電壓：3.2 kV；氮氣流速：800 L／h；離子源溫度：150 ℃；干燥氣溫度：550 ℃；多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式：母離子m／ z 359.2，子離子m／ z 296.0（定量離子）、m／ z 324.0；碰撞電壓：18，20 V；區(qū)帶電壓：30，30 V。

2.2 溶液制備

取馬兜鈴酸Ⅰ對照品適量，精密稱定，用70%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL 的對照品溶液。取裝量差異項下供試品，粉碎成細粉，取適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為33 kHz）處理30 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別按制劑處方和工藝制備缺木香、馬兜鈴、尋骨風、天仙藤、朱砂蓮、細辛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下條件進樣測定，記錄色譜圖及質(zhì)譜圖，詳見圖1、圖2。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

圖1 離子流色譜圖Fig.1 Ion flow chromatograms

圖2 馬兜鈴酸Ⅰ的質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)式圖Fig.2 The mass spectrum and chemical structures of aristolochic acid Ⅰ

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2 項下對照品溶液，用70% 甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.046 55，0.232 80，0.931 00，4.655 00，9.310 00 μg／mL 的系列對照品溶液。按2.1 項下條件進樣測定，記錄峰面積。以馬兜鈴酸Ⅰ質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝13 222 X ＋55.6，R2＝0.999 9( n ＝5）。結(jié)果表明，馬兜鈴酸Ⅰ質(zhì)量濃度在0.046 55 ～9.310 00 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限考察：分別精密量取2.2 項下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1 項下條件進樣測定，以信噪比( S／ N)10 ∶1 和3 ∶1 分別計算定量限、檢測限。結(jié)果定量限、檢測限分別為0.05 ng 和0.015 ng。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液適量，按2.1 項下條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD 為1.60%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫放置0，2，4，8，12 h 時按2.1 項下條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD 為1.30%（n ＝5），表明供試品溶液在室溫放置12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密稱取同一批樣品適量，各6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD 為1.90%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品適量，共6 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 馬兜鈴酸Ⅰ加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test of aristolochic acid Ⅰ（n ＝6）

2.4 樣品含量測定

取58 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定結(jié)果（μg／g，n ＝3）Tab.2 Determination results of aristolochic acid Ⅰin the samples（μg／g，n ＝3）

3 討論

本研究中檢測的13 種中成藥中馬兜鈴酸Ⅰ的含量差異較大，主要原因是中藥材的來源不同，每種中藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量差異較大。另外，在國家允許的情況下，有些藥材可替代使用，但使用過程中須注意交叉混淆、同物異名、同名異物等現(xiàn)象。為了保證用藥安全，應(yīng)注意做好對含馬兜鈴酸的藥材和替代品應(yīng)用的考察。

按歐盟標準，選擇1 個母離子和2 個子離子，并依據(jù)子離子豐度比和化合物保留時間對馬兜鈴酸Ⅰ進行定性分析。質(zhì)譜中常選用的母離子有[M ＋H]＋，[M ＋NH4]＋，[M－H]－等。以直接進樣的方式考察馬兜鈴酸Ⅰ的質(zhì)譜行為，結(jié)果母離子[M ＋NH4] ＋在被打碎后進入二級質(zhì)譜形成的子離子穩(wěn)定性較好。馬兜鈴酸Ⅰ母離子合理丟失后形成響應(yīng)較高的子離子分別為 m／ z 296[M1＋H－NO2]＋，m／ z 324[M1＋H－H2O]＋。利用MRM模式對選定的定性碎片離子進行離子傳輸電壓、碰撞電壓、倍增電壓等參數(shù)優(yōu)化，最終篩選出m／ z 359.2→296.0 為定量離子對，m／ z 359.2→324.0 為定性離子對。按各個品種的處方和工藝制成陰性對照品，并加入適量的馬兜鈴酸Ⅰ對照品，制成供試品溶液，測定各品種的方法檢測限。同時，按處方和工藝制成陽性樣品作為質(zhì)控樣品，以提高測定的準確性。

綜上所述，所建立的方法專屬性強，快速、靈敏，可用于中成藥中馬兜鈴酸Ⅰ的質(zhì)量控制。