止得咳顆粒中連翹酯苷A 成分鑒定及含量測定*

梁 潔，祁金麗，周昱杉，胡 玨，陳輝華，孫正伊，朱 華，趙立春△

（1. 廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200； 2. 廣西中醫藥大學廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西南寧 530200； 3. 廣西中醫藥大學廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術研究中心，廣西 南寧 530200；4. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011）

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UPLC－Q－TOF／MS 儀，包括二元泵、自動進樣器、柱溫箱、PDA 檢測器、電噴霧離子源（ESI）、XEVO G2－S型質譜儀（美國Waters 公司）；1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；KQ－100DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AFZ－1001－U 型艾科浦超純水系統（重慶頤洋企業發展有限公司）；XS104 型分析天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為十萬分之一）；TGL－16G 型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥

止得咳顆粒（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，批號分別為20190701，20190702，20190703，規格為每袋15 g）；缺龍葉的陰性樣品；連翹酯苷A 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111810－201707，含量為97.2%）；甲醇、甲酸、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～1 min 時10%A→30%A，1 ～2 min 時30%A→35%A，2 ～2.5 min 時35%A→40%A，2.5 ～5 min 時40%A→43%A，5 ～7 min 時43%A→60%A，7 ～9 min 時60%A→90%A，9 ～12 min 時90%→95%A，12 ～12.1min 時95%A→10%A，12.1 ～14min 時10%A）；流速為0.4 mL／min；柱溫為40 ℃；進樣量為0.5 μL。

質譜條件：離子掃描方式為ESI－；毛細管電壓為2.8 kV；錐孔電壓為40 V；離子源溫度為100 ℃；溶劑揮散溫度為400 ℃；脫溶氣流量為700 L／h；掃描范圍為100 ～1 500 Da。

2.1.2 溶液制備

稱取連翹酯苷A11.84mg，精密稱定，置5mL 容量瓶，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為2.368 mg／mL的對照品溶液。取樣品粉末約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15 mL 甲醇，稱定質量，超聲（功率為250 W，頻率為50 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，13 000 r／min 離心10 min，取上清液，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按止得咳顆粒處方和工藝制備缺龍葉的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 化學成分分析

取2.1.2 項下供試品溶液適量，按2.1.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果所測得的精確分子量與理論分子量比較，誤差＜3×10－6，表明檢測結果準確。一級質譜圖（圖2）中可見負離子m／ z 為623.199 2[M－H]－，精準分子式為C29H36O15，表明相對分子質量為624；二級質譜圖（圖3）中可見碎片離子峰m／ z 623.194 1，461.165 6，179.032 4，161.023 5，135.0433，113.0233。根據質譜數據，并結合文獻[9－10]，推測該成分是連翹酯苷A。

要建立農業科研項目的績效評價結果的長效運用機制。首先，擴大績效評價應用范圍。將農業科研項目過程考評與年度總結報告結合，項目結果考評與項目驗收結合，促進績效評價與預算編制、預算執行和監督等各環節有機結合。

圖1 UPLC－Q－TOF／MS ESI－模式下止得咳顆粒的基峰離子流色譜圖Fig.1 Base－peak ion flow chromatogram of Zhideke Granules in UPLC－Q－TOF／MS ESI － mode

圖2 一級質譜圖Fig.2 Primary mass spectrum

圖3 二級質譜圖Fig.3 Secondary mass spectrum

2.2 定量分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex XB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）－0.2%磷酸溶液（B），梯 度 洗脫（0 ～5 min 時35%A→40%A，5 ～15 min 時40%A→42%A，15 ～20 min 時42%A，20 ～30 min，42%A→60%A）；流速：1.0 mL ／ min；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 方法學考察

專屬性試驗：取2.1.2 項下3 種溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖4。陰性對照品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

圖4 高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.1.2 項下對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列對照品溶液。精密量取10 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以連翹酯苷A 質量濃度（X，mg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝18 523.525 1 X－56.976 6（r ＝0.999 8，n ＝6）。結果表明，連翹酯苷A 質量濃度在0.023 7 ～0.236 8 mg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限考察：分別精密量取2.1.2 項下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比( S／ N)3 ∶1、10 ∶1 時分別計算檢測限和定量限。結果連翹酯苷A 的檢測限和定量限分別為0.592 μg／mL，1.972 μg／mL。

穩定性試驗：取樣品（批號為20190703）適量，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，16，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果連翹酯苷A 峰面積的RSD 為2.27%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號為20190703）適量，共6 份，每份5.0 g，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果連翹酯苷A 平均含量為0.176 3 mg／g，RSD 為1.61%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20190703）適量，共9 份，分別加入低、中、高質量濃度的連翹酯苷A 對照品溶液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝9）

2.2.3 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，分別按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件平行進樣測定3 次，記錄峰面積，并計算含量。結果批號為20190701，20190702，20190703 的樣品中連翹酯苷A 含量分別為0.194 9，0.198 1，0.178 2 mg／g，平均0.190 4 mg／g( RSD ＝4.58%）。

3 討論

3.1 提取溶劑、提取時間和提取方式考察

預試驗中考察了甲醇（100%，75%，50%）及乙醇（100%，75%，50%），以及超聲和回流提取的效果，還考察了超聲提取15，30，60 min 的效果，結果以100%甲醇溶液提取效果最好，超聲提取法優于回流提取法，提取30 min 和60 min 的含量差異不大。考慮到連翹酯苷A較不穩定，故選擇提取時間為30 min。

3.2 色譜條件選擇

預試驗中，為了確定測定連翹酯苷A 含量的最優色譜條件，分別對流動相系統、柱溫、流速等進行了考察。流動相體系考察了甲醇溶液、乙腈溶液、甲醇－0.2%磷酸溶液及乙腈－0.2%磷酸溶液，結果表明，后兩者洗脫效果均優于前兩者，最終選用穩定性最好的甲醇－0.2%磷酸溶液；考察洗脫方式時發現，等度洗脫時始終不能將目標峰與其他峰分開，分離度低，故選擇了梯度洗脫方式，并篩選出了最佳梯度洗脫程序；流速考察了0.8，1.0，1.2 mL／min，最終采用了洗脫效果較好的1.0 mL／min；柱溫考察了25，30，35 ℃，發現柱溫對目標峰的整體影響較小，故選用分離度及峰形較好的30 ℃；通過對連翹酯苷A 對照品溶液的全波長掃描，發現其在330 nm 波長處具有最佳吸收波長，故作為檢測波長。

3.3 方法評價

本研究中對止得咳顆粒中目標峰進行UPLC－QTOF／MS 定性鑒別，判斷該成分為連翹酯苷A，并采用HPLC 法測定了止得咳顆粒中連翹酯苷A 的含量，所建立的方法簡便，結果準確，重復性好，專屬性強，可用于測定止得咳顆粒中連翹酯苷A 的含量。