彝心康膠囊質量標準提升研究

覃媛媛，楊宗榮，羅艷珠，溫吉星

（1. 云南省楚雄彝族自治州食品藥品檢驗所，云南 楚雄 675000； 2. 云南龍發制藥股份有限公司，云南 楚雄 675000）

彝心康膠囊由雞血藤、燈盞細辛、五氣朝陽草、透骨草等7 味中藥材經提取制成的彝藥制劑，功效為理氣活血、通經止痛（彝醫稱為烏諾衣諾、四乃土），臨床用于治療氣滯血瘀所致胸痹心痛、心悸怔忡，以及冠心病、缺血性腦血管病見上述癥狀者。其現行標準為國家藥品監督管理局標準[WS－10277（ZD－0277）－2002]，鑒別項下僅有姜黃及木香的薄層鑒別，含量項下僅有虎杖中大黃素的含量測定。本研究中新增薄層色譜（TLC）法對雞血藤和燈盞細辛進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定虎杖中虎杖苷和燈盞細辛中野黃芩苷含量，旨在提升其質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1100 型高效液相色譜儀，含VWD 檢測器（美國Agilent 公司）；BP211D 型電子分析天平（德國賽多利斯電子公司，精度為0.01 mg）；MS304 TS／02 型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司，精度為0.1 mg）；GoodLook－1000 型薄層色譜成像系統（上海科哲生化科技有限公司）；ELGA 超純水機（法國威立雅公司）；SB25－12DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；薄層預制G 板（青島海洋化工廠分廠、煙臺市化學工業研究所、德國Merck 公司）。

1.2 試藥

芒柄花素對照品（批號111703－201504，供鑒別用），虎杖苷對照品（批號為111575－201603，含量為87.3%），野黃芩苷對照品（批號為110758－201616，含量為91.7% ），雞血藤對照藥材（批號為121173－201805），燈盞細辛對照藥材（批號為121269－201103），均購自中國食品藥品檢定研究院；彝心康膠囊（批號分別為180501，180502，180503，180504，180901，180902，180903，180904，181001，181002），陰性樣品，均購自云南龍發制藥股份有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

雞血藤：取樣品內容物1.5 g，精密稱定，加乙醇40 mL，超聲(功率200 W，頻率40 kHz，下同)處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，用乙酸乙酯10 mL 振搖提取，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，經中性氧化鋁柱（中性氧化鋁200 ～300 目，5 g，內徑為1.5 cm，干法裝柱），用80%甲醇60 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮30 min，濾過，濾液加乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。取芒柄花素對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的對照品溶液。取缺雞血藤的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照TLC法試驗，精密吸取供試品溶液、陰性對照品溶液和對照藥材溶液各4 μL，對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（20 ∶1，V／ V）為展開劑，預飽和15 ～30 min，展開，取出，晾干，置氨氣中熏后，在紫外光（254 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

燈盞細辛：取樣品內容物1.5 g，精密稱定，加0.2%碳酸氫鈉溶液15 mL，浸泡過夜，濾過，濾液用稀硫酸調pH 至3.0，加無水甲醇20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，用正丁醇振搖提取2 次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取燈盞細辛對照藥材1 g，同其供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取野黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的對照品溶液。取缺燈盞細辛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液，照TLC 法試驗，吸取上述4 種溶液各1 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以冰醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 B。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－0.2%磷酸溶液（14 ∶86，V／ V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：335 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取虎杖苷和野黃芩苷對照品各適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL 含野黃芩苷40.348 μg 和虎杖苷111.744 μg 的混合對照品溶液。取樣品內容物0.3 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。分別取不含虎杖藥材和不含燈盞細辛藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性和系統適用性試驗：分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、缺虎杖的陰性對照品溶液、缺燈盞細辛的陰性對照品溶液各10 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上有相同色譜峰，且主峰與相鄰色譜峰能完全分離，峰形良好，陰性對照無干擾；理論板數以虎杖苷峰和野黃芩苷峰計應不低于5 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取混合對照品溶液1，2，3，5，10，15 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y）、進樣量為橫坐標（X）進行線性回歸，得虎 杖 苷 回 歸 方 程 Y1＝2 017.363 X1＋182.490（R2＝0.999 2，n ＝6），野黃芩苷回歸方程Y2＝2 844.953 X2＋44.924（R2＝0.999 5，n ＝6）。結果表明，虎杖苷和野黃芩苷進樣量分別在0.112 ～1.676 μg 和0.040 ～0.605 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.2.1 項下色譜條件重復進樣6 次。結果虎杖苷和野黃芩苷平均峰面積分別為2 675.672 和1 274.369，RSD 分別為0.68%和0.38%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取混合對照品溶液和供試品（批號為180501）溶液，室溫下按2.2.1 項下色譜條件分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h 時進樣測定，記錄色譜圖。結果混合對照品溶液和供試品溶液中虎杖苷和野黃芩苷峰面積的RSD 分別為0.40%和0.32%，1.33%和1.19%（n ＝8），表明2 種溶液室溫下24 h 內均穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為180501）樣品內容物6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，以2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果虎杖苷和野黃芩苷平均含量分別為8.351 5 mg／g 和2.657 6 mg／g，RSD 分別為0.63%和0.35%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品（批號180501）內容物6 份，每份0.15 g，精密加入相當于樣品中所含虎杖苷和野黃芩苷量100%的對照品貯備液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取10 批樣品，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算含量，結果見表2。

表2 10 批樣品中虎杖苷和野黃芩苷含量測定結果（mg／粒，n ＝2）Tab.2 Content determination of polydatin and scutellarin in 10 batches of samples（mg／capsule，n ＝2）

3 討論

3.1 TLC 條件篩選

雞血藤：雞血藤TLC 為新增項，在進行方法摸索時，首先參照2015 年版《中國藥典(一部)》[1]（注：作者試驗時2020 年版《中國藥典》尚未正式執行，且2020 年版《中國藥典》此項無改動，下同）中“雞血藤”鑒別項下方法，因樣品為復方制劑，其余處方藥材對雞血藤的干擾較大，TLC 結果欠佳，后參照2015 年版《中國藥典(一部)》“花紅片”項下鑒別（3）、“花紅膠囊”項下鑒別（3）、“止痛化片”項下鑒別（6）及文獻[2－3]的展開系統確定了雞血藤的TLC 方法。以上資料中均僅使用對照藥材作為對照，通過文獻[4]確定芒柄花素為雞血藤中特征性成分，因此加入芒柄花素對照品協同雞血藤對照藥材作為雙對照。

燈盞細辛：燈盞細辛TLC 為新增項，由文獻[5]可知，燈盞細辛中含有野黃芩苷、咖啡酸等化學成分，通過文獻[6]確定了燈盞細辛的TLC 方法。在預試驗中同時也增加了咖啡酸對照品，但相同的TLC 條件下咖啡酸對照品斑點不明顯，因此最終未選擇咖啡酸作為對照。

3.2 TLC 耐用性考察

分別采用前述不同來源的薄層板，分別在無飽和、預飽和30 min、預飽和60 min，低溫（5 ～15 ℃）、常溫（20 ～30 ℃）、高溫（40 ～50 ℃），低濕度（相對濕度30% ～40%）、高濕度（相對濕度65% ～75%）條件下考察，均能獲得良好的色譜分離效果，斑點清晰、圓整，且陰性對照無干擾。雞血藤TLC 在不飽和的情況下會發生邊緣效應，故規定預飽和時間為15 ～30 min，進而形成文中有效的鑒別方法。

3.3 HPLC 檢測波長選擇

通過文獻[5，7]可知，虎杖和燈盞細辛中分別含有虎杖苷、野黃芩苷2 種有效成分。分別取虎杖苷對照品和野黃芩苷對照品，用甲醇溶解后，以甲醇作空白對照，在紫外可見區進行全波段掃描，虎杖苷和野黃芩苷分別在318 nm 和335 nm 波長處有最大吸收，結合紫外響應值大小、色譜峰峰形尖銳、陰性無干擾等條件，選擇335 nm作為檢測波長。

3.4 HPLC 方法選擇

流動相：在摸索虎杖和燈盞細辛的含量測定方法時，參考2015 年版《中國藥典(一部)》[1]中“虎杖”“護肝寧片”“燈盞細辛”“燈盞生脈膠囊”“燈盞花素片”含量測定項下色譜條件及文獻[8－9]，分別考察了乙腈－水（15 ∶85 和23 ∶17，V／ V），乙腈－0.2%磷酸溶液（15 ∶85 和14 ∶86，V／ V），甲醇－0.2%磷酸溶液（35 ∶65 和30 ∶70，V／ V），乙腈－四氫呋喃－0.2%磷酸溶液（14 ∶14 ∶72，V／ V／ V）等不同配比作為流動相進行試驗，結果表明，乙腈－0.2%磷酸溶液（14 ∶86，V／ V）為最佳流動相，能使被測成分與其他成分較好地分離，峰形好，陰性對照無干擾。

提取溶劑和提取方法：考察了水、稀乙醇、50%甲醇、甲醇4 種溶劑的提取效果，采用50%甲醇提取時得率最高，測定無干擾，測定峰與相鄰雜質峰分離度均在1.5 以上，故采用50%甲醇作為提取溶劑。同時考察了超聲處理（250 W，50 kHz）、60 ℃振搖、加熱回流3 種提取方法的效果，結果顯示，超聲提取和加熱回流提取對2 種有效成分的影響相似，但超聲提取操作簡單易行，故采用超聲提取；以50%甲醇為溶劑時，考察了超聲處理（250 W，50 kHz）15，30，45，60 min 對2 種有效成分提取效果的影響，發現超聲30 min 時2 種有效成分基本提取完全，故被選用。

耐用性：同時對不同廠家、型號色譜柱（Agilent Eclipse XDB－C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent 5 HC－C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Thermo AcclaimTM120－C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Shiseido CAPCELL PAK MGⅡ－C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），不同柱溫（25，30，35，40 ℃），不同流速（0.8，1.0，1.2 mL／min）條件進行了考察，結果上述色譜條件的色譜峰峰形、分離度、理論板數發生一定程度變化時，均能滿足試驗要求，耐用性較好。

3.5 方法評價

本研究中建立的TLC 法專屬性強、靈敏度高，HPLC 法簡便可行，結果準確、可靠，重復性、穩定性好，可用于彝心康膠囊的質量控制。