生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室生物安全風(fēng)險因子分析及防控措施

王寵,鄭琳琳,王在峰

（山東省濟(jì)南生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，山東濟(jì)南250101）

2004年SARS實驗室感染以及2020年新型冠狀病毒肺炎的全球性爆發(fā)，實驗室生物安全問題引起了政府和公眾的廣泛關(guān)注。科技部出臺指導(dǎo)意見（國科發(fā)社〔2020〕25號），要求“加強(qiáng)對實驗室，特別是對病毒的管理，確保生物安全”。2004年發(fā)布的《病原微生物實驗室生物安全管理條例》(國務(wù)院令第424號)規(guī)定：根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對個體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類：第一類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物；第二類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物；第三類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險有限，實驗室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物；第四類病原微生物，是指在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。其中，第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物,高致病性病原微生物實驗室是實驗室工作人員職業(yè)性感染的主要來源之一[1]。根據(jù)該管理條例，2005年，原農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《動物病原微生物分類名錄》（農(nóng)業(yè)部令第53號）；2006年，原衛(wèi)生部發(fā)布了《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)科教發(fā)〔2006〕15號）。

《檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定生態(tài)環(huán)境監(jiān)測機(jī)構(gòu)評審補(bǔ)充要求》(國市監(jiān)檢測〔2018〕245號)規(guī)定，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測包括水和廢水、環(huán)境空氣和廢氣、海水、土壤和生物等13大類，其中微生物監(jiān)測是生物監(jiān)測的主要類別，微生物指標(biāo)屬于衛(wèi)生指標(biāo)，在評價水質(zhì)衛(wèi)生、生物毒性等方面具有化學(xué)指標(biāo)不可比擬的優(yōu)勢，是生態(tài)環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的重要指標(biāo)之一。生物風(fēng)險評估作為生物安全管理的核心工作之一，越來越受到重視。然而，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室生物安全水平如何？重點關(guān)注的生物安全風(fēng)險因子有哪些？尚未見有文獻(xiàn)報道。為加強(qiáng)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室生物安全管理，保護(hù)實驗室工作人員的健康，有必要開展生物安全風(fēng)險因子分析，識別重點生物安全風(fēng)險因子，特別是在致病性和傳染性等方面，采取防控措施，加強(qiáng)重點管控，確保生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室生物安全風(fēng)險可防可控。

1 微生物指標(biāo)

主要的環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和污染物排放標(biāo)準(zhǔn)中列有微生物指標(biāo)，如糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）、總大腸菌群、細(xì)菌總數(shù)（菌落總數(shù)）和大腸埃希氏菌等，在醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)中還含有腸道病毒、腸道致病菌（沙門氏菌和志賀氏菌）和結(jié)核桿菌等指標(biāo)，其中結(jié)核桿菌為高致病性病原微生物，詳見表1和表2。

表1 主要環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的微生物指標(biāo)

表2 主要排放標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)

為配套環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和污染物排放標(biāo)準(zhǔn)，生態(tài)環(huán)境部制修訂了微生物指標(biāo)的行業(yè)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)6項（包括1項正在征求意見階段），具體項目包括糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）、總大腸菌群、細(xì)菌總數(shù)（菌落總數(shù)）、大腸埃希氏菌等，使用的方法有多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法等，詳見表3。目前，從生物安全性和方法適用性等方面考慮，各級生態(tài)環(huán)境監(jiān)測機(jī)構(gòu)主要開展糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）、總大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)（菌落總數(shù)）等3種微生物指標(biāo)的監(jiān)測工作，不開展結(jié)核桿菌等高致性病原微生物的監(jiān)測。

表3 微生物指標(biāo)的行業(yè)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)

2 生物安全風(fēng)險因子分析

參照《實驗室生物安全手冊》[2]，根據(jù)含致病微生物類別和數(shù)量或濃度，將生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室生物安全風(fēng)險因子分成高、較高、中、較低和低等五類，分別對應(yīng)高、較高、中、較低和低等五類風(fēng)險水平，詳見表4。生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室生物安全風(fēng)險要素主要包括菌株、樣品、培養(yǎng)物和實驗室“三廢”等4類，對生物安全風(fēng)險要素開展逐項分析。

表4 風(fēng)險因子分類

2.1 菌株

生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室共用到10種菌株，包括標(biāo)準(zhǔn)菌株和滅菌指示菌株，其中標(biāo)準(zhǔn)菌株主要用于質(zhì)量控制，包括陽性和陰性菌株，詳見表5 。

表5 生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室常用的菌株種類

對照《人間傳染的病原微生物名錄》和《動物病原微生物分類名錄》2個病原微生物名錄，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室常用的10種菌株中產(chǎn)氣腸桿菌和金黃色葡萄球菌等2種屬于第三類病原微生物，評價為“中”風(fēng)險因子；大腸埃希氏菌、克雷伯氏菌屬和假單胞菌屬等3類有個別種類屬于第三類，實驗過程中避免使用，其他種類均為第四類病原微生物，評價為“低”風(fēng)險因子；糞鏈球菌等5種均為第四類病原微生物，評價為“低”風(fēng)險因子，詳見表6。

表6 菌株類別

2.2 樣品

地表水、地下水和生活飲用水等環(huán)境樣品

不具備傳染性和致病性，評價為“低”風(fēng)險因子。而城鎮(zhèn)污水處理廠、生活垃圾填埋場等污水和污泥樣品一般沒有傳染性和致病性，評價為“較低”風(fēng)險因子，而醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物特別是傳染病和結(jié)核病醫(yī)療機(jī)構(gòu)的污水和污泥樣品，由于滅菌效果的不確定性，存在潛在的高致病病原微生物，具有潛在的傳染性和致病性，評價為“中”風(fēng)險因子。

2.3 培養(yǎng)物

細(xì)菌總數(shù)僅是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的指標(biāo)，雖然，營養(yǎng)瓊脂具有普適性，適合多數(shù)細(xì)菌生長，但水環(huán)境樣品的培養(yǎng)物風(fēng)險較低，評價為“較低”風(fēng)險因子。而醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)的微生物指標(biāo)為糞大腸菌群，使用的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基適合大量細(xì)菌生長，而EC培養(yǎng)基雖然可抑制革蘭氏陽性菌的生長，但是其他類別的革蘭氏陰性菌也可生長。考慮到培養(yǎng)物的濃度和劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于樣品，因此，其相應(yīng)風(fēng)險水平要提高一級，將醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物特別是傳染病和結(jié)核病醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的培養(yǎng)物，評價為“較高”風(fēng)險因子；而城鎮(zhèn)污水處理廠、生活垃圾填埋場等污水和污泥樣品培養(yǎng)物有潛在的傳染性和致病性，評價為“中”風(fēng)險因子。

2.4 實驗室“三廢”

2.4.1 廢水

經(jīng)滅菌處理后的水質(zhì)樣品和培養(yǎng)物等，評價為“低”風(fēng)險因子。

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2.4.2 廢氣

微生物監(jiān)測產(chǎn)生的氣溶膠，均被生物安全實驗室和生物安全柜高效過濾器收集，不再產(chǎn)生廢氣。

2.4.3 固體廢物

采樣人員、接樣人員和分析人員使用的一次性口罩、手套和培養(yǎng)皿、試管和97孔盤等耗材，根據(jù)所接觸的樣品、菌株和培養(yǎng)物的風(fēng)險水平，選擇最高風(fēng)險水平作為其風(fēng)險水平，但是經(jīng)過滅菌處理后，評價為“低”風(fēng)險因子；生物安全實驗室和生物安全柜高效過濾器富集了大量潛在致病微生物，且生物安全柜高效過濾器不定期檢測老化后會引起的實驗室污染的風(fēng)險[3]，因此，評價為“較高”風(fēng)險因子。

2.5 生物安全風(fēng)險因子識別

經(jīng)生物安全要素全面分析，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室不操作高致病性病原微生物，因此，不存在“高”風(fēng)險因子。但是，醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物特別是傳染病和結(jié)核病醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的培養(yǎng)物及其操作過程中產(chǎn)生的固體廢物（包括待處理的生物安全實驗室和生物安全柜高效過濾器），存在潛在高致病性病原微生物，評價為“較高”風(fēng)險因子；產(chǎn)氣腸桿菌和金黃色葡萄球菌等第三類致病菌株和城鎮(zhèn)污水處理廠、生活垃圾填埋場等污水和污泥樣品培養(yǎng)物以及操作過程中產(chǎn)生的固體廢物，風(fēng)險水平次之，評價為“中”風(fēng)險因子，詳見表7。

表7 “較高”和“中”風(fēng)險因子

3 感染和致病風(fēng)險

3.1 日常期間

因為生態(tài)環(huán)境監(jiān)測實驗室“較高”和“中”生物安全風(fēng)險因子的存在，雖然實驗室三區(qū)（清潔區(qū)，半污染區(qū)和污染區(qū)）劃分明顯[4]，但實驗室仍然存在感染或致病的風(fēng)險[5]。包括人員事先未被告知實驗室的生物危害，未進(jìn)行相應(yīng)防護(hù)而誤闖實驗室，導(dǎo)致感染的風(fēng)險；接種環(huán)滅菌存在感染性物質(zhì)飛濺及散布的風(fēng)險；標(biāo)本或菌液轉(zhuǎn)運過程中存在由于不慎滑落、潑灑、刺傷等意外，導(dǎo)致標(biāo)本泄露或職業(yè)暴露的風(fēng)險[6]，如俄羅斯某實驗室一名女科學(xué)家由于意外被一根帶有埃博拉病毒的針刺破手而死亡[7]；實驗室監(jiān)測人員自我防護(hù)意識不足，不按規(guī)定穿戴白大手套和口罩，實驗完畢后不洗手消毒；不按規(guī)范進(jìn)行實驗操作和處理“三廢”等等。

3.2 重大傳染病疫情期間

4 防控措施

病原微生物或潛在的高致病性病原微生物等生物安全風(fēng)險因子會給實驗室人員帶來一定的感染或致病風(fēng)險，但是采取系列防控措施，生物安全風(fēng)險是可防可控的。

（1）建設(shè)生物安全實驗室和使用生物安全柜。按照國家對實驗室實行分級管理要求，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測微生物實驗室因操作第三類致病微生物，需要建設(shè)生物安全二級實驗室，國家標(biāo)準(zhǔn)[10，11]有具體建設(shè)要求。同時為滿足對人員、樣品和環(huán)境的保護(hù)要求，需使用二級生物安全柜。

（2）按照CNAS準(zhǔn)則[12，13]要求，建立生態(tài)環(huán)境監(jiān)測微生物實驗室的生物安全體系，建立二級生物安全實驗室生物安全流程[5]，明確生物安全責(zé)任人及其崗位職責(zé)，建立微生物實驗室管理制度、實驗室生物安全事故（包括生物危險物質(zhì)溢灑）的處理程序以及生物危險因子清單等。

（3）加強(qiáng)關(guān)鍵生物安全風(fēng)險因子的管理。重點關(guān)注“較高”和“中”生物安全風(fēng)險因子：規(guī)范實驗操作，實驗操作過程中盡可能避免病原微生物氣溶膠產(chǎn)生，避免使用玻璃銳器；加強(qiáng)日常防護(hù)，采取必要的安全防護(hù)[14]；做好滅菌消毒，并監(jiān)控滅菌效果，定期使用生物指示物（嗜熱脂肪桿菌芽孢生物指示物）檢查滅菌設(shè)備的效果并記錄，指示物應(yīng)放在不易達(dá)到滅菌的部位；生物安全實驗室和生物安全柜高效過濾器建議委托專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行處置，固體廢物不能作為可利用廢物處理或變賣；對第三類致病微生物的標(biāo)準(zhǔn)菌種實現(xiàn)雙鎖雙人管理；實驗室應(yīng)配備洗眼器和噴淋裝置等安全防護(hù)裝置等等。

（4）強(qiáng)化重大傳染病疫情期間防控措施。為應(yīng)對新冠病毒疫情，生態(tài)環(huán)境部于2020年2月1日印發(fā)《關(guān)于做好新型冠狀病毒感染的肺炎疫情醫(yī)院污水和城鎮(zhèn)污水監(jiān)管工作的通知》，對醫(yī)療和城鎮(zhèn)污水的處理提出了新要求。山東省也修訂醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放地方標(biāo)準(zhǔn)[15]，增加了重大傳染病疫情期間相關(guān)控制要求章節(jié)，并加嚴(yán)了糞大腸菌群數(shù)限值，提出了糞大腸菌群數(shù)和總余氯的測定宜采用現(xiàn)場快速測定或在線監(jiān)測方法等措施。這期間須更加關(guān)注“較高”和“中”生物安全風(fēng)險因子，更加規(guī)范實驗操作，切實落實個人防護(hù)措施等。