多元復合調理劑對鎘砷污染農田土壤微生物群落結構的影響

曾 鵬,蔣 毅,辜嬌峰,周 航,劉 雅,廖柏寒 (中南林業科技大學環境科學與工程學院,湖南 長沙 410004)

土壤鈍化修復技術主要是通過添加化學調理劑改變土壤中重金屬的賦存形態來降低農作物對重金屬的吸收,是一種有效的農田重金屬污染土壤修復技術[1-3].目前,常用于重金屬污染農田土壤修復的調理劑有碳酸鈣[4]、石灰[5]、生物炭[6]、海泡石[7]等.鎘(Cd)和砷(As)是常見的土壤污染元素.一般而言,污染土壤中Cd主要以Cd2+,而As主要以AsO43-和AsO33-形態存在[8],故這兩種元素在土壤中賦存形態的差異使單一土壤調理劑無法同時有效鈍化 Cd和As,減少農作物對 Cd和As的吸收與轉運.因此,大量研究開始轉向利用多種調理劑進行復合后用于修復農田Cd和As復合污染農田土壤.

多元復合調理劑已廣泛用于修復農田As和Cd復合污染土壤[2,9-10].研究表明,施用石灰石、海泡石和硫酸鐵三元復合調理劑能顯著降低土壤可交換態Cd和As含量和水稻Cd和As吸收[9].施用碳酸鈣、偏高嶺土和鈣鎂磷肥元復合調理劑,水稻糙米中Cd和As含量降低,且與土壤中Cd和As各形態含量顯著相關[11].通過原位添加羥基磷灰石、沸石和生物炭三元復合調理劑可有效降低水稻對 Cd和 As的吸收,并促進水稻增產[12].堿性肥料和硅鈣調理劑組配可降低水稻根系對土壤中 Cd和 As吸收,稻米中 Cd和 As含量分別顯著降低 43.8%和32.1%[10].因此,利用多元調理劑進行復合后可同時控制水稻對 Cd和 As的吸收,降低糙米 Cd和As含量.

土壤微生物是維持土壤生物學特性的重要組成部分[13],其中微生物群落和多樣性的變化可用來研究多元調理劑對重金屬污染土壤的生態調節作用,并判斷多元調理劑對農田土壤生態安全的影響.然而,大量研究僅僅集中于多元調理劑對土壤重金屬有效性以及水稻對Cd和As吸收和富集特征的影響,而忽視了添加的調理劑對土壤中微生物群落和土壤生態安全的影響.有研究表明,石灰配施腐殖酸或生物質炭可對降低土壤中重金屬的生物有效性,增強土壤微生物基礎呼吸強度和土壤微生物量碳含量[14].施用海泡石、石灰、秸稈生物炭和螯合鐵肥可改變土壤中重金屬賦存形態進而改變農田土壤微生物群落結構[15].施用有機肥和石灰石可顯著提高重金屬污染土壤的微生物活性[16].因此,土壤微生物群落結構的變化一定程度可有效反應添加調理劑對農田土壤生態安全的影響.目前,大量研究表明,石灰石、鐵粉、硅肥和鈣鎂磷肥在調控水稻Cd和As吸收方面有突出的效果[11,17-19].然而,基于多元土壤調理劑對污染土壤中微生物群落及其生態安全的影響鮮有研究.

本研究通過溫室盆栽試驗,研究添加多元土壤調理劑(石灰石、鐵粉、硅肥和鈣鎂磷肥)對土壤基本理化性質、As和Cd的生物有效性、微生物群落結構和農田生態安全的影響,探究多元復合調理劑作用下土壤環境因子與微生物群落結構的聯系,評估多元復合調理劑對農田土壤生態環境質量的影響,以期為應用多元復合調理劑原位修復和治理 Cd和As復合污染農田土壤提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 供試土壤與材料

供試土壤采自湖南省郴州市臨武縣某Cd和As復合污染的稻田耕作表層土壤(經度 25°19'24",緯度112°35'22").供試土壤的基本物理化學性質見表1.與《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準(試行)》(GB 15618—2018)[20]風險篩選值相比,該農田土壤屬于Cd和As復合污染.收集的土壤經自然風干后過5mm篩后用于盆栽試驗.

表1 供試土壤的基本物理化學性質Table 1 Basic physiochemical properties of tested soil

多元復合調理劑(LISP)按一定質量比的石灰石、鐵粉、硅肥和鈣鎂磷肥混合組成.石灰石采購自石天津市大茂化學試劑廠,主要成分為重質碳酸鈣.鐵粉采購自購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,主要成分為零價鐵.硅肥采購自天津市風船化學試劑科技有限公司,主要成份為 Na2SiO3·9H2O.鈣鎂磷肥采購自湖南省寧鄉縣鈣鎂磷肥廠,其中 P2O5含量為12%～16%,CaO含量為25%～30%,MgO含量為8%.石灰石、鐵粉、硅肥和鈣鎂磷肥中原始 Cd和As含量均未檢測出.

水稻(Oryza sativa L.)品種選用晚稻品種深優5814(雜交秈稻,湖南金色農豐有限公司).

1.2 試驗設計

4kg過 5mm 篩的土壤裝入圓形塑料桶(桶高29cm,內徑 25cm)后,分別添加質量比為 0%(CK)、0.1%(T1)、0.2%(T2)和0.4%(T3)的LISP復合調理劑.混合均勻后,每盆加入 1.12g CO(NH2)2、0.84g(NH4)3PO4和0.88g K2CO3作為基肥.每個處理3次重復.保持田間持水率下,培養20d后,移栽無污染土壤培育、長勢良好的水稻幼苗(五葉一心),每盆1穴2株.水稻種植期澆灌自來水保持一定的水層深度(2～4cm),水稻收割前2～3d停止灌溉至表層土壤發白.水稻成熟后,收集水稻根際土壤,一部分用于土壤基本理化性質的測定,一部分新鮮土壤樣品用于DNA的提取.

1.3 測試與分析

土壤基本物理化學性質(pH值、陽離子交換量、有機質、堿解氮、總磷和有效磷)根據魯如坤[21]的方法進行分析和測定.土壤總 Cd采用王水-高氯酸混酸消解[21],總 As采用(1+1)王水水浴法消解[21].土壤有效態Cd和As采用DTPA浸提[22-23].消解和浸提液中Cd含量采用ICP-AES(ICP 6300,Thermo)測定.消解和浸提液中As含量均用原子熒光分光光度計(AFS-8220,北京吉天儀器有限公司)測定.國家標準物質土壤(GBW-070009)和空白試驗用于樣品分析過程的質量控制.Cd和As回收率分別為90.1%～105.3%和90.0%～110.0%.

1.4 土壤DNA提取和微生物群落結構分析

采用 NucleoSpin?96Soil土壤 DNA提取土壤DNA,-20℃保存.細菌V3 V4可變區采用正向引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和反向引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')進行PCR擴增(9902,96well PCR儀,上海吉泰依科賽生物科技有限公司).PCR擴增反應條件為:95℃預變形 5min;25個循環(95 ℃ ,3 0s;50 ℃ , 3 0s;72℃,40s);72 ℃ ,7min.PCR 擴增產物經過純化、定量和均一化形成測序文庫,質檢合格的文庫用 Illumina HiSeq 2500(美國Illumina公司)進行測序.

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2016分析數據.采用SPSS 16.0對數據進行顯著性檢驗和相關性分析.使用Mothur(version v.1.30)軟件,對樣品α-多樣性指數進行計算和評估.土壤微生物群落的主成分分析(PCA)、非度量多維標定法(NMDS)、熱圖和Mantel檢驗分析等在百邁克生物云平臺完成.采用 Canoco 5.0對微生物群落結構進行冗余分析.

2 結果與分析

2.1 LISP處理下土壤基本理化性質的變化

從表2可看出,隨著LISP添加量的增加,土壤有機質和堿解氮含量無顯著變化,但土壤pH值、陽離子交換量、有效磷和總磷含量呈現增加趨勢.在 T1和T2處理下,土壤pH值、陽離子交換量和總磷含量較CK相比無明顯影響;而在T3處理下,土壤pH值較CK處理顯著(P＜0.05)提高0.57單位;土壤陽離子交換量較對照顯著(P＜0.05)提高57.64%.與CK處理相比,T1和 T2處理下土壤有效磷含量分別顯著(P＜0.05)提高26.59%和25.00%,尤其在0.4% LISP處理下,土壤有效磷和總磷含量分別顯著(P＜0.05)提高130.6%和18.38%.本研究結果表明,添加0.1%～ 0.2%的LISP對土壤的基本理化性質無明顯影響,而0.4% LISP處理可有效提高土壤pH值、陽離子交換量和土壤磷含量.

表2 LISP處理下土壤基本理化性質的變化Table 2 Change of basic physiochemical properties in the soil under the LISP treatment

2.2 LISP對土壤Cd和As有效性的影響

LISP對土壤Cd和As有效性的影響見圖1.與對照(CK)相比,T1—T3處理下土壤有效態 Cd和 As含量分別顯著(P＜0.05)降低 10.25%～21.76%和 10.60%～16.39%,表明 LISP可同時有效降低土壤中Cd和As的生物有效性.其中,土壤有效態 Cd含量與 pH值呈負相關;土壤有效態As含量與有效磷含量顯著(r=—0.644,P＜0.05)負相關;土壤陽離子交換量分別與有效態 Cd(r=-0.778,P＜0.01)和有效態 As(r=-0.715,P＜0.01)顯著負相關(表3).

表3 土壤Cd和As有效態含量與土壤基本理化性質的相關性分析Table 3 The relationship between contents of available Cd and As and basic physicochemical properties in the soil

圖1 LISP處理下土壤中有效態Cd和As含量的變化Fig.1 Change of available Cd and As contents in soil under LISP treatment

2.3 LISP對土壤微生物群落多樣性的影響

LISP處理下土壤微生物群落的OTUs數量和多樣性指數的變化見表4.在T1、T2和T3處理下,土壤中微生物的OTUs數量和Shannon多樣性指數與CK處理相比無顯著差異,而ACE和Chao指數出現增加趨勢,但差異不顯著,表明LISP對土壤中微生物群落的豐富度和多樣性的無明顯影響.

表4 LISP處理下對土壤微生物α-多樣性的影響Table 4 Effects of LISP treatment on soil microbial α-diversity

基于OTU分類水平,采用主成分分析(PCA)和非度量多維標定法(NMDS)研究添加不同量的LISP對土壤微生物β—多樣性的影響(圖2).從PCA可看出,PC軸 1和 2的貢獻率分別為 70.90%和19.06%,累計貢獻率89.96%,同時 NMDS分析的強度小于 0.2,表明 PCA和 NMDS可有效解釋不同LISP添加量下土壤微生物群落結構的相似性.從圖2可看出,T1、T2和 T3處理下土壤微生物群落與CK處理相比具有顯著差異,進一步表明添加 LISP可有效改變污染土壤微生物群落.且T1、T2和T3處理之間的土壤微生物群落結構也具備顯著差異,表明LISP添加量的差異亦可進一步改變土壤微生物群落結構.

圖2 LISP處理下對土壤微生物β-多樣性的影響Fig.2 Effects of LISP treatment on β-diversity of soil microbial community

2.4 LISP對土壤微生物群落結構的影響

添加LISP后,土壤中的微生物主要隸屬于厚壁菌門(Firmicutes,占比 21.88%～37.51%)、變形菌門(Proteobacteria,占比 17.36%～22.48%)、綠彎菌門(Chloroflexi,占 比 11.81%～16.94%)、放線菌門(Actinobacteria,占比 6.61%～13.66%)、酸桿菌門(Acidobacteria,占比 6.24%～8.48%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae,占 比 5.40%～9.05%)、 擬 桿 菌 門(Bacteroidetes,占 比 3.15%～5.82%)、 浮 霉 菌 門(Planctomycetes,占比 1.18%～9.58%)、疣微菌門(Verrucomicrobia,占比 0.76%～2.07%)等(圖 3),表明上述微生物是污染土壤中主要優勢物種.同時,T1—T3處理下土壤中厚壁菌門、放線菌門和浮霉菌門等門水平物種的相對豐度增加,而綠彎菌門、酸桿菌門和疣微菌門等門水平物種的相對豐度降低(圖3).

圖3 LISP處理下土壤主要門水平物種分布Fig.3 The distribution of main microorganisms at phylum level under LISP treatment

從屬水平可進一步看出,LISP可影響土壤中微生物群落的組成.在 T3處理下,節桿菌屬(Arthrobacter)、虛構芽胞桿菌屬(Fictibacillus)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、Defluviicoccus、水球菌屬(Aquisphaera)、Singulisphaera、Candidatus Udaeobacter、類芽孢桿菌(Paenibacillus)等微生物的相對豐度較對照升高,而地桿菌屬(Geobacter)、Syntrophorhabdus、纖繩菌屬(Leptolinea)、厭氧粘細菌(Anaeromyxobacter)、馬賽菌屬(Massilia)等微生物的相對豐度較對照明顯降低(圖4).

圖4 LISP處理下土壤主要屬水平物種分布Fig.4 Soil bacterial community at genus level under LISP treatment

2.5 土壤環境因子與微生物群落結構的聯系

將細菌主要門水平微生物與土壤環境因子結合進行冗余分析(RDA),結果如圖5所示.RDA分析的軸 1和軸 2對土壤細菌群落的解釋量分別為63.07%和13.43%,表明RDA分析能有效反應微生物群落與土壤環境因子之間的聯系.從圖 5可看出,土壤pH值、有效磷、總磷、陽離子交換量、以及土壤有效態As和Cd與土壤微生物群落結構呈現正相關,其中pH值、有效磷和有效態As與微生物群落呈顯著正相關(表5).

圖5 LISP處理下土壤微生物群落的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of soil microbial community under LISP treatment

3 討論

本研究中添加 0.4%LISP可顯著改變土壤的基本理化性質,其中土壤pH值、陽離子交換量、有效磷和總磷含量顯著提高.土壤pH值上升的原因可能與LISP中含有堿性的石灰石和鈣鎂磷肥,可一定程度提高土壤pH值.與史磊等[24]研究發現石灰配施鈣鎂磷肥可顯著提高土壤pH值的研究結果一致.土壤陽離子交換量含量增加的原因則可能與隨著 LISP添加量的增加,進而攜帶大量的 Ca2+、Mg2+、Fe3+等陽離子進入土壤有關.辜嬌峰等[25]發現羥基磷灰石、沸石和改性秸稈炭組成的復合調理劑可顯著提高土壤的陽離子交換量,與本研究結果一致.土壤有效磷和總磷提高的原因則與鈣鎂磷肥是復合調理劑的主要成分,一定程度上提高土壤的磷含量有關.鄢德梅等[26]研究發現鈣鎂磷肥分別與石灰、海泡石復合可顯著提高土壤有效磷,與本研究結果一致.本研究結果表明,添加0.4% LISP處理可顯著提高土壤pH值、陽離子交換量和土壤磷含量.

LISP可有效降低土壤中Cd和As的生物有效性.其中,有效態Cd含量與土壤pH值和陽離子交換量呈負相關(表 3).有研究表明,土壤有效態 Cd含量降低與土壤pH值和陽離子交換量的提高有關[2].土壤pH值升高會增強土壤中帶負電荷的膠體和OH–與Fe、Mn等離子形成羥基化合物對Cd離子的吸附能力,使Cd2+形成 Cd(OH)2或 CdCO3,從而降低土壤中Cd的生物有效性[9].同時,LISP成分中石灰石和鈣鎂磷肥所含的 Ca2+能與 Cd2+發生共沉淀,從而促進土壤中Cd向殘渣態Cd的轉化,降低土壤中Cd的生物有效性[27].硅也可通過形成硅酸鹽絡合物和硅醇基(Si—OH)來改變土壤中 Cd的賦存形態,從而降低 Cd的生物可利用性[28].LISP復合調理劑成分中石灰石和鈣鎂磷肥所含的Ca亦能與As形成砷酸鈣等難溶性沉淀,增加土壤吸附As的能力,從而影響土壤中 As的生物有效性[26].硅肥可通過專性吸附,鈣鎂磷肥中的磷酸鹽可通過絡合反應等方式來降低土壤中As的生物有效性[29-30].土壤有效態As含量與有效磷含量顯著(r=—0.644,P＜ 0.05)負相關(表 3).鐵粉可通過氧化還原反應生成 FeOOH,進一步氧化形成無定形的鐵氫氧化合物(am—FeOOH),上述產物可為Cd和As提供更多的吸附位點[18].因此,LISP中多種材料的相互作用可同時有效鈍化污染土壤中的Cd和As.

土壤微生物群落的結構和多樣性易受重金屬污染的影響,因此土壤微生物多樣性被認為是修復重金屬污染土壤過程的敏感指標[31].LISP處理對土壤中微生物群落的豐富度和多樣性的影響較小.與Mench等[32]研究發現在輕度Cd污染土壤中施用棕色角閃石和鐵砂對細菌豐富度無明顯影響的結果一致.然而,在螯合鐵肥,復合碳酸鈣、鈣鎂磷肥和含硫有機物,以及復合爐渣和生物炭處理下,土壤微生物群落的多樣性和豐度均降低而不利于微生物生長[15,33-34].因此,添加LISP可維持污染土壤中正常微生物群落的多樣性和豐富度,對農田土壤的生態安全無明顯影響.然而,基于 PCA和 NMDS分析表明LISP可顯著影響土壤微生物群落的β-多樣性,且不同添加量的影響具有顯著差異.有研究表明,土壤中添加石灰、有機肥、螯合鐵肥等材料可有效改變土壤中微生物群落的形成[15,35].Pei等[31]也發現海泡石和蚯蚓糞復合調理劑可顯著改變污染土壤微生物群落的 β-多樣性.因此,添加 LISP可改變土壤微生物群落的組成和結構,而對土壤微生物的豐富度和多樣性影響較小.

LISP處理下土壤中厚壁菌門、放線菌門和浮霉菌門等門水平物種的相對豐度增加,而綠彎菌門、酸桿菌門和疣微菌門等門水平物種的相對豐度降低(圖 3).蘭玉書等[15]研究發現施加鈍化劑后導致土壤厚壁菌門相對豐度增加,而綠彎菌門相對豐度降低,與本研究結果一致.酸桿菌門嗜酸,不利于在堿性環境中生存[35-36].添加LISP使土壤pH值增加,且土壤pH值與酸桿菌門呈顯著負相關(圖5),可能是導致土壤中酸桿菌門相對豐度降低的原因.因此,添加土壤調理劑和種植過程可改變土壤pH值、土壤環境和養分含量,影響土壤中某些微生物的生長和代謝活動,進而影響微生物群落結構[37].有研究表明,施用磷肥可導致放線菌門和浮霉菌門相對豐度增加,而綠彎菌門和疣微菌門相對豐度降低[38].放線菌門和浮霉菌門具有溶磷作用[38],因此可將鈣鎂磷肥中難利用的無機磷轉化為作物可吸收利用的磷形態,進而一定程度提高土壤中有效態磷含量.本研究中 LISP含有鈣鎂磷肥,可有效提高土壤中有效態磷含量,一定程度影響土壤微生物群落的組成.

在0.4%LISP處理下,節桿菌屬、虛構芽胞桿菌屬、慢生根瘤菌屬、Defluviicoccus、Singulisphaera、類芽孢桿菌等微生物的相對豐度較對照升高,而地桿菌屬、厭氧粘細菌、馬賽菌屬等微生物的相對豐度較對照明顯降低.其中地桿菌屬、厭氧粘細菌等屬于鐵還原菌[39],其相對豐度下降的原因可能是由于施加LISP中的鐵粉屬于還原鐵粉,在土壤中通過氧化反應生產Fe2+和Fe3+,從而影響土壤中鐵還原菌的生長和繁殖.馬賽菌屬易受土壤 pH 值影響[40],本研究中添加LISP可顯著改變土壤pH值而影響馬賽菌屬的相對豐度.節桿菌屬、Singulisphaera、類芽孢桿菌和Defluviicoccus具有溶磷作用[38,41-43],表明LISP中的鈣鎂磷肥可能會促進溶磷細菌的生長,且溶磷細菌分泌有機和無機酸性等物質可提高土壤中磷的有效性.虛構芽胞桿菌屬于固氮菌,可顯著影響水稻苗期對Cd的吸收[44].慢生根瘤菌屬具備固氮作用,對 As的生物有效性有重要影響[45].研究結果表明,LISP有利于土壤節桿菌屬、Singulisphaera、Fictibacillus、慢生根瘤菌屬等微生物的生長和繁殖,在調節土壤物理化學性質和鈍化Cd和As等方面發揮重要的作用.

一般而言,土壤中重金屬有效性與微生物群落結構呈現負相關[13,46].本研究中,添加LISP可有效降低土壤Cd和As的生物有效性,來緩解重金屬對土壤微生物群落結構的不利影響.研究表明,土壤穩定化修復過程中,土壤pH值和重金屬有效性可有效影響重金屬污染土壤細菌群落結構[47],而土壤pH值是影響微生物群落的關鍵因素[15,35,46].本研究中,添加LISP可提高土壤有效磷和 pH 值(表 2),表明添加LISP主要通過改變土壤有效磷和pH值來調控土壤微生物群落結構.土壤微生物結構對環境變化較為敏感[31],且土壤物理化學性質的變化在調節微生物對重金屬的適應過程中起著重要作用[48].因此,添加LISP可提高土壤有效磷和pH值,降低土壤As和Cd的生物有效性,進而調節土壤微生物對重金屬污染環境的適應性.

4 結論

4.1 添加LISP可顯著改變農田土壤的基本理化性質,降低土壤Cd和As的有效性,且對土壤微生物α—多樣性無明顯影響,但顯著改變土壤 β—多樣性.與CK相比,在0.4%的LISP處理下土壤pH值、土壤有效磷和總磷含量分別顯著(P＜0.05)提高 0.57單位、130.6%和18.38%,同時土壤有效態Cd和As含量分別顯著(P＜0.05)降低21.76%和16.39%.

4.2 高通量測序結果表明,LISP處理下土壤中厚壁菌門、放線菌門和浮霉菌門等門水平物種的相對豐度增加,尤其是有利于土壤中節桿菌屬、Singulisphaera、Fictibacillus、慢生根瘤菌屬等益生微生物的生長和繁殖.LISP可顯著改變土壤微生物群落的組成和結構,其中土壤pH值和有效磷的增加,以及土壤有效態As和Cd含量的降低是調控土壤微生物群落的主要環境因子.因此,多元復合調理劑LISP可提高土壤pH值和磷含量,同時降低Cd和As的生物有效性,對農田土壤的生態安全無明顯影響.