傳代培養(yǎng)對(duì)嵌合型非整倍體計(jì)數(shù)嵌合比例的影響＊

王 興，楊 靜 ,劉芙蓉，郝勝菊，張 釧 ,劉自華

（1.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院兒童發(fā)育行為科，甘肅 蘭州 730050 3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院輸血科，甘肅 蘭州 730050）

關(guān)鍵字：傳代培養(yǎng)；嵌合體；非整倍體

人類(lèi)正常體細(xì)胞是包括22 對(duì)常染色體和1 對(duì)性染色體（XX/XY），屬于二倍體生物細(xì)胞。當(dāng)整倍體染色體中缺少或額外增加一條或若干條染色體時(shí)稱(chēng)為非整倍體，一般是在減數(shù)分裂時(shí)一對(duì)同源染色體不分離或提前分離而形成n-1 或n+1 的配子，這類(lèi)配子彼此結(jié)合或同正常配子(n)結(jié)合，產(chǎn)生各種非整倍體細(xì)胞。較為常見(jiàn)的非整倍體有21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征以及性染色體數(shù)目異常導(dǎo)致的克氏/特納綜合征等[1]。而在非整倍體患者存在一種特殊類(lèi)型，即同時(shí)存在正常細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞的嵌合體，該類(lèi)患者的病情輕重往往與其異常細(xì)胞的嵌合比例及來(lái)源胚層相關(guān)[2]。

染色體核型分析是目前診斷非整倍體異常最常用的方法，但該方法檢測(cè)前需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是羊水細(xì)胞常需要傳代培養(yǎng)。本研究通過(guò)對(duì)兩例嵌合型非整倍體患者外周血細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用FISH 檢測(cè)計(jì)數(shù)異常核型細(xì)胞的嵌合比例，探討傳代培養(yǎng)對(duì)嵌合型非整倍體計(jì)數(shù)嵌合比例的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2019 年在我院確診的1 例嵌合型21-三體綜合征患者和1 例嵌合型特納綜合征患者，經(jīng)患者知情同意，采其外周血樣本進(jìn)行研究。

1.2 方法

①細(xì)胞培養(yǎng)：肝素抗凝管采集患者3mL 外周血，取0.5mL 作為原代分析樣本；取0.2mL 接種于外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液（河南賽諾特生物技術(shù)有限公司）中37℃培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h 后，取0.5mL 樣本作為傳代1分析樣本；取0.2mL 培養(yǎng)后樣本再次傳代培養(yǎng)72h 后，取0.5mL 樣本作為傳代2分析樣本。

②FISH 實(shí)驗(yàn)：采用含GLP13/21、CSP18/X/Y 兩組熒光探針的FISH 非整倍體檢測(cè)試劑盒（北京金菩嘉試劑有限公司），經(jīng)外周血組織標(biāo)本經(jīng)制片處理后進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。

③FISH 結(jié)果判讀：使用徠卡DM6000B 熒光顯微鏡觀察，GLP13/21 探針組中GLP21 探針示紅色信號(hào)，CSP18/X/Y 探針組中CSPX 示綠色信號(hào)、CSPY探針示紅色信號(hào)，選擇背景干凈、信號(hào)清晰、形態(tài)完整的細(xì)胞，計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞內(nèi)FISH 的雜交信號(hào)。

2 結(jié)果

對(duì)兩例樣本三個(gè)培養(yǎng)水平（原代、傳代1、傳代2）的FISH 檢測(cè)結(jié)果顯示，

嵌合型21-三體綜合征和特納綜合征患者的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)傳代培養(yǎng)后，異常細(xì)胞所占比例逐漸下降。嵌合型21-三體綜合征異常細(xì)胞比例分別為94.5%（189/200）、82.5%（165/200）、69.5%（139/200）；嵌合型特納綜合征異常細(xì)胞比例分別為71.0%（142/200）、36.5%（73/200）、27.5%（55/200）。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 FISH 檢出異常核型細(xì)胞比例

3 討論

嵌合型非整倍體患者體內(nèi)同時(shí)包含兩種以上核型的細(xì)胞系，其臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度往往與異常細(xì)胞的嵌合比例呈正相關(guān)，異常核型細(xì)胞占比越高，其臨床表現(xiàn)越重；反之，則越輕。然而，也有少數(shù)病例會(huì)出現(xiàn)核型比例與臨床癥狀不相關(guān)的現(xiàn)象，這可能與體細(xì)胞鑲嵌體有關(guān)[3]。

國(guó)內(nèi)研究顯示在實(shí)施胎兒羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析時(shí)出現(xiàn)嵌合體的情況達(dá)0.29%～0.46%[4～6]，并且進(jìn)行后續(xù)臍血核型分析時(shí)，部分嵌合體轉(zhuǎn)正常。出現(xiàn)這種情況，有學(xué)者認(rèn)為是羊水細(xì)胞包括了胎兒三個(gè)胚層的細(xì)胞，而臍血來(lái)源于循環(huán)系統(tǒng)，屬于中胚層細(xì)胞，故兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果存在偏差可能是由于檢測(cè)樣本胚層來(lái)源不同造成的[5,7]。同時(shí)根據(jù)Hook等人[8]曾提出“救援”細(xì)胞系(rescue line)學(xué)說(shuō)，認(rèn)為存活的特納綜合征患者，在個(gè)體不同組織當(dāng)中必定存在“救援”細(xì)胞系，患者才能夠存活，即認(rèn)為特納綜合患者體內(nèi)除45，X0 核型外，具有正常的46，XX細(xì)胞系作為“救援”細(xì)胞系存在于患者發(fā)育的不同階段或不同組織中。基于上述假設(shè)，目前常規(guī)染色體核型分析方法檢測(cè)到70%特納綜合征患者為染色體嵌合體核型，其余30%患者有可能存在的嵌合體核型沒(méi)有被準(zhǔn)確檢出。

傳代培養(yǎng)在細(xì)胞生長(zhǎng)不良時(shí)，可大大提高細(xì)胞的培養(yǎng)成功率，尤其在產(chǎn)前羊水細(xì)胞培養(yǎng)中，減少對(duì)孕婦及胎兒二次羊水穿刺傷害[9]。本研究意在探討傳代培養(yǎng)對(duì)嵌合型非整倍體計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，我們使用兩例已確診嵌合型非整倍體外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用FISH 技術(shù)計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示異常核型細(xì)胞占比在傳代培養(yǎng)后逐漸降低，該結(jié)果與Atkins[10]和Sultana[11]等人對(duì)嵌合型特納綜合征患者進(jìn)行研究顯示培養(yǎng)后的性腺組織細(xì)胞中異常核型占比較培養(yǎng)前減少相符，說(shuō)明在體外細(xì)胞培養(yǎng)中不同細(xì)胞系間可能存在生長(zhǎng)優(yōu)劣勢(shì)的差異性。

因此，嵌合型染色體核型的檢出受到分析細(xì)胞數(shù)目、檢測(cè)樣本類(lèi)型、檢測(cè)方法以及體內(nèi)外不同細(xì)胞系的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)等因素影響，導(dǎo)致最終的分析結(jié)果無(wú)法與患者的表型完全相符。根據(jù)本研究中顯示的傳代培養(yǎng)中正常核型細(xì)胞處于優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，在臨床工作中選擇性的傳代培養(yǎng)進(jìn)行核型檢測(cè)，有利于嵌合型非整倍體的檢出率；同時(shí)，原代細(xì)胞能更好的反應(yīng)患者真實(shí)嵌合比例情況。