傳代培養對嵌合型非整倍體計數嵌合比例的影響＊

王 興，楊 靜 ,劉芙蓉，郝勝菊，張 釧 ,劉自華

（1.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學第二醫院兒童發育行為科，甘肅 蘭州 730050 3.蘭州大學第二醫院輸血科，甘肅 蘭州 730050）

關鍵字：傳代培養；嵌合體；非整倍體

人類正常體細胞是包括22 對常染色體和1 對性染色體（XX/XY），屬于二倍體生物細胞。當整倍體染色體中缺少或額外增加一條或若干條染色體時稱為非整倍體，一般是在減數分裂時一對同源染色體不分離或提前分離而形成n-1 或n+1 的配子，這類配子彼此結合或同正常配子(n)結合，產生各種非整倍體細胞。較為常見的非整倍體有21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征以及性染色體數目異常導致的克氏/特納綜合征等[1]。而在非整倍體患者存在一種特殊類型，即同時存在正常細胞和非整倍體細胞的嵌合體，該類患者的病情輕重往往與其異常細胞的嵌合比例及來源胚層相關[2]。

染色體核型分析是目前診斷非整倍體異常最常用的方法，但該方法檢測前需要進行細胞培養，尤其是羊水細胞常需要傳代培養。本研究通過對兩例嵌合型非整倍體患者外周血細胞進行傳代培養，使用FISH 檢測計數異常核型細胞的嵌合比例，探討傳代培養對嵌合型非整倍體計數嵌合比例的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2019 年在我院確診的1 例嵌合型21-三體綜合征患者和1 例嵌合型特納綜合征患者，經患者知情同意，采其外周血樣本進行研究。

1.2 方法

①細胞培養：肝素抗凝管采集患者3mL 外周血，取0.5mL 作為原代分析樣本；取0.2mL 接種于外周血淋巴細胞培養液（河南賽諾特生物技術有限公司）中37℃培養細胞培養箱中培養72h 后，取0.5mL 樣本作為傳代1分析樣本；取0.2mL 培養后樣本再次傳代培養72h 后，取0.5mL 樣本作為傳代2分析樣本。

②FISH 實驗：采用含GLP13/21、CSP18/X/Y 兩組熒光探針的FISH 非整倍體檢測試劑盒（北京金菩嘉試劑有限公司），經外周血組織標本經制片處理后進行熒光原位雜交實驗。

③FISH 結果判讀：使用徠卡DM6000B 熒光顯微鏡觀察，GLP13/21 探針組中GLP21 探針示紅色信號，CSP18/X/Y 探針組中CSPX 示綠色信號、CSPY探針示紅色信號，選擇背景干凈、信號清晰、形態完整的細胞，計數200 個細胞內FISH 的雜交信號。

2 結果

對兩例樣本三個培養水平（原代、傳代1、傳代2）的FISH 檢測結果顯示，

嵌合型21-三體綜合征和特納綜合征患者的外周血淋巴細胞進傳代培養后，異常細胞所占比例逐漸下降。嵌合型21-三體綜合征異常細胞比例分別為94.5%（189/200）、82.5%（165/200）、69.5%（139/200）；嵌合型特納綜合征異常細胞比例分別為71.0%（142/200）、36.5%（73/200）、27.5%（55/200）。檢測結果見表1。

表1 FISH 檢出異常核型細胞比例

3 討論

嵌合型非整倍體患者體內同時包含兩種以上核型的細胞系，其臨床表現嚴重程度往往與異常細胞的嵌合比例呈正相關，異常核型細胞占比越高，其臨床表現越重；反之，則越輕。然而，也有少數病例會出現核型比例與臨床癥狀不相關的現象，這可能與體細胞鑲嵌體有關[3]。

國內研究顯示在實施胎兒羊水細胞培養染色體核型分析時出現嵌合體的情況達0.29%～0.46%[4～6]，并且進行后續臍血核型分析時，部分嵌合體轉正常。出現這種情況，有學者認為是羊水細胞包括了胎兒三個胚層的細胞，而臍血來源于循環系統，屬于中胚層細胞，故兩個檢測結果存在偏差可能是由于檢測樣本胚層來源不同造成的[5,7]。同時根據Hook等人[8]曾提出“救援”細胞系(rescue line)學說，認為存活的特納綜合征患者，在個體不同組織當中必定存在“救援”細胞系，患者才能夠存活，即認為特納綜合患者體內除45，X0 核型外，具有正常的46，XX細胞系作為“救援”細胞系存在于患者發育的不同階段或不同組織中。基于上述假設，目前常規染色體核型分析方法檢測到70%特納綜合征患者為染色體嵌合體核型，其余30%患者有可能存在的嵌合體核型沒有被準確檢出。

傳代培養在細胞生長不良時，可大大提高細胞的培養成功率，尤其在產前羊水細胞培養中，減少對孕婦及胎兒二次羊水穿刺傷害[9]。本研究意在探討傳代培養對嵌合型非整倍體計數結果的影響，我們使用兩例已確診嵌合型非整倍體外周血淋巴細胞進行傳代培養，使用FISH 技術計數，結果顯示異常核型細胞占比在傳代培養后逐漸降低，該結果與Atkins[10]和Sultana[11]等人對嵌合型特納綜合征患者進行研究顯示培養后的性腺組織細胞中異常核型占比較培養前減少相符，說明在體外細胞培養中不同細胞系間可能存在生長優劣勢的差異性。

因此，嵌合型染色體核型的檢出受到分析細胞數目、檢測樣本類型、檢測方法以及體內外不同細胞系的優勢生長等因素影響，導致最終的分析結果無法與患者的表型完全相符。根據本研究中顯示的傳代培養中正常核型細胞處于優勢生長的現象，在臨床工作中選擇性的傳代培養進行核型檢測，有利于嵌合型非整倍體的檢出率；同時，原代細胞能更好的反應患者真實嵌合比例情況。