表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑AG1478 對卵巢癌細胞生物活性及纖溶酶原激活物抑制物1 的作用機制研究△

丁伯勇，王瑋，昝瑛

商洛市中心醫院1腫瘤科，2婦科，陜西 商洛 726000 3西安交通大學第二附屬醫院腫瘤科，西安 721000

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，根據中國惡性腫瘤數據分析，中國有超過5 萬患者患有卵巢癌，病死率超過50%。卵巢位置隱蔽，多數患者確診時往往失去最佳治療時機，化學治療成為改善卵巢癌患者預后的主要治療方法。卵巢癌細胞生長速度快，向鄰近器官及淋巴結轉移較快，化療能夠通過增加腫瘤細胞DNA 鏈損傷而抑制DNA 復制及轉錄，減少卵巢癌細胞活性及生長。但是隨著臨床的應用，部分患者出現藥物不耐受或化療耐藥，導致臨床療效較差，因此，如何抑制卵巢癌細胞增殖，加快凋亡仍是眾多研究者探討的難題。卵巢癌的產生是由多因素、多因子共同作用的結果，纖溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1）主要位于人體第7 號染色體上，是絲氨酸蛋白酶抑制物的成員之一，主要在內皮細胞中被合成，具有抑制纖溶酶原激活物，增加惡性腫瘤細胞活性的作用。卵巢癌細胞中PAI-1 表達升高，臨床發現PAI-1 可以特異性結合某信號后發揮抗腫瘤細胞侵襲作用。目前，隨著卵巢癌分子機制的研究，多種致癌基因及抑癌基因在腫瘤中的作用機制逐漸被闡明，靶向治療將成為攻克卵巢癌的主要方法。在卵巢癌分子機制深入研究中，酪氨酸激酶受體家族及其轉導信號的功能失常導致卵巢癌細胞生物學行為異常，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是酪氨酸激酶受體家族成員之一，存在酪氨酸激酶活性，能夠結合表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）發揮細胞信號轉導作用而影響細胞生物學行為。卵巢癌組織中EGFR 表達是正常組織的多倍以上，因此，EGFR 抑制劑能夠成為治療卵巢癌的潛在靶點。AG1478 是EGFR 高效選擇性酪氨酸激酶抑制劑，已經證實具有抗肺癌、肝癌細胞生長及促進凋亡作用。但是關于AG1478對卵巢癌的體外干預研究比較少見，所以，本研究以此作為創新點分析AG1478 對卵巢癌細胞生物學行為及PAI-1 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器

CaOV-3 細胞購自上海名勁生物科技有限公司；AG1478 購自上海甄準生物科技有限公司。胎牛血清購自上海冰晴生物科技有限公司；PAI-1 抗體購自上海信裕生物科技有限公司；尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR）抗體購自北京博邁斯科技發展有限公司；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl terazolium，MTT）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自金克隆（北京）生物技術有限公司；Trizol 購自北京柏萊斯特科技發展有限公司。蛋白電泳儀購自萊普特科學儀器（北京）有限公司；逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒和儀器均購自上海康朗生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

將低溫冷藏的CaOV-3 細胞快速移入37 ℃水中溶解，3000 r/min 離心10 min（離心半徑15 cm），離棄上清液，加入培養基，5%CO、37.5 ℃培養，細胞貼壁生長，1～2 天更換新的無血清培養液，細胞生長到90%時，加入蛋白液消化，傳代保存，以備后用。

1.3 藥物配置及分組

AG1478 溶解在DMSO 溶液中，配置成5、10、15、20 μmol 濃度的儲蓄液，保存環境為-20 ℃；CaOV-3 細胞分為空白組和干預組，空白組為無藥物干預的CaOV-3 細胞，干預組分別為干預A 組（5 μmol 的AG1478 溶液）、干預B 組（10 μmol 的AG1478 溶液）、干預C 組（15 μmol 的AG1478 溶液）和干預D 組（20 μmol 的AG1478 溶液），采用不同濃度的AG1478 干預。

1.4 MTT 法檢測CaOV-3 細胞抑制率

采用傳代方法將各組CaOV-3 細胞按5×10/ml接種到96 孔板中，于含有1%胎牛血清的培養基中同步消化。吸去原培養液，每個濃度6 個復孔，均加入5 mg/ml 的MTT 溶液20 μl，培養24、48、72 h后，吸棄培養液，再在每個孔中加入50 μl DMSO，搖勻后放入490 nm 波長下檢測光密度（optical density，OD）值，取3 次平均值，細胞抑制率（%）=100%-（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD值-空白組OD 值）×100%。

1.5 流式細胞儀檢測CaOV-3 細胞凋亡率

將0.25%蛋白酶消化的CaOV-3細胞以5×10/ml接種到胎牛血清培養基中過夜，24 h 后，收集每組細胞，選擇3 個樣本，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌1 次，100 μl 接種于5 ml 流式試管中，將5 μl 的膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）與5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）混合后染色，無光條件下，孵育15 min 后注入400 μl 結合緩沖液混勻，予以洗滌3 次，后采用流式細胞儀分析CaOV-3細胞凋亡率。

1.6 Transwell 小室檢測CaOV-3 細胞侵襲能力

各組CaOV-3 細胞數目為5×10/ml，將50 mg/L的基質膠稀釋后加入小室上層，上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養基，培養48 h，拭去殘留細胞，0.1%結晶紫染色，計算CaOV-3 侵襲細胞數。

1.7 蛋白質印跡（Western blot）法檢測PAI-1 和uPAR 蛋白表達

各組CaOV-3 細胞接種、數量同上，加入少量胰蛋白酶消化后，運轉離心機后保留上清液，放入樣孔中，進行電泳實驗。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜用TBS 緩沖液浸泡10 min，反復PBS 沖洗，每次5 min，加入一抗PAI-1、uPAR和GAPDH 抗體（1∶500），二抗加入羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（1∶2000），雜交沖洗。后將膜浸入電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

1.8 RT-PCR 法檢測PAI-1、uPAR mRNA

檢測CaOV-3 細胞株中

PAI

-

1

、

uPAR

基因，嚴格按照PCR 儀器說明書進行操作。各組5×10/ml 的CaOV-3 細胞用0.125%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心20 min（離心半徑15 cm），采用Trizol 法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA 反轉錄為cDNA，獲得反轉錄體系，條件：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃終點。每個細胞設置6 個復孔，以

GAPDH

為內參，反應條件為95 ℃預作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，共40個循環（表1）。

表1 引物序列

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 AG1478 對CaOV-3 細胞抑制率的影響

不同時間點各組CaOV-3 細胞抑制率比較，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。不同時間點干預B組、干預C組和干預D組CaOV-3細胞抑制率均高于干預A組，干預D組CaOV-3細胞抑制率均高于干預B 組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；其余干預組間比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同時間點各組CaOV-3細胞抑制率的比較（%，±s）

2.2 AG1478 對CaOV-3 細胞凋亡率的影響

各組CaOV-3 細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（

P

＜0.01）。干預組CaOV-3 細胞凋亡率均高于空白組，干預B 組、干預C 組、干預D 組CaOV-3細胞凋亡率均高于干預A 組，干預D 組CaOV-3細胞凋亡率高于干預B 組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表3、圖1）

圖1 流式細胞儀檢測各組CaOV-3細胞的凋亡率

表3 各組CaOV-3 細胞凋亡率的比較（%，±s）

2.3 AG1478 對CaOV-3 細胞侵襲數目的影響

各組CaOV-3 細胞侵襲數目比較，差異有統計學意義（

P

＜0.01）。干預組CaOV-3 細胞侵襲數目均少于空白組，干預B 組、干預C 組及干預D 組CaOV-3 細胞侵襲數目均少于干預A 組，干預D 組CaOV-3 細胞侵襲數目少于干預B 組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（圖2、表4）

表4 各組CaOV-3 細胞侵襲數目的比較（±s）

圖2 Transwell小室檢測各組CaOV-3細胞侵襲能力（結晶紫染色，×200）

2.4 Western blot法檢測PAI-1、uPAR蛋白表達情況

各組CaOV-3 細胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達量比較，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。干預組CaOV-3 細胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達量均低于空白組，干預B 組、干預C 組及干預D 組CaOV-3 細胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達量均低于干預A 組，干預D 組CaOV-3 細胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達量均低于干預B 組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表5、圖3）

圖3 Western blot法檢測各組CaOV-3細胞中PAI-1和uPAR蛋白表達情況

表5 各組CaOV-3 細胞中PAI-1 和uPAR 蛋白表達量的比較（±s）

2.5 RT-PCR 法檢測PAI-1、uPAR mRNA 表達情況

各組CaOV-3 細胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 比較，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。干預組CaOV-3細胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 均低于空白組，干預B組、干預C 組及干預D 組CaOV-3 細胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 均低于干預A 組，干預D 組CaOV-3 細胞中

PAI

-

1

、

uPAR

mRNA 均低于干預B 組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表6）

表6 各組CaOV-3 細胞中PAI-1、uPAR mRNA 表達水平的比較（±s）

3 討論

目前，降低卵巢癌細胞生長、侵襲的干預機制在于減少腫瘤細胞核中DNA 復制及合成，或抑制DNA 有絲分裂，對腫瘤細胞產生毒性損傷，但是缺點在于不能排除對非腫瘤細胞的破壞，損害機體免疫功能。腫瘤分子生物學的研究開創了治療卵巢癌等多種惡性腫瘤的新紀元，靶向治療方法在治療腫瘤疾病中具有重要意義。卵巢癌患者中發現酪氨酸激酶受體家族的異常表達，因此，以酪氨酸激酶受體作為靶點的治療，通過使腫瘤細胞內酪氨酸激酶結構域發生改變使其活性受到抑制。AG1478 是EGFR 靶向抑制劑，在以往文獻中證實能夠抑制宮頸癌、乳腺癌、胃癌及子宮內膜癌細胞生長。

卵巢癌細胞生物學行為異常是腫瘤發生、發展的重要因素，因此了解其影響生物學行為的關鍵因子至關重要。EGFR 可以在細胞表面被檢測，是一種跨膜糖蛋白，是細胞生長調節因子，當EGFR異常時細胞增殖不受控制，發生持續性增殖，導致惡性轉化。卵巢癌細胞EGFR 過度激活可引起下游一系列信號轉導，進一步誘發卵巢癌細胞快速生長、分化導致細胞永生化。張寶月和張俊農研究表示，卵巢癌細胞中存在EGFR 表達，結合相應配體后會啟動腫瘤細胞生長周期，酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）信號可激活腫瘤細胞信號轉導系統，將生長信號傳遞至細胞核內，刺激卵巢癌細胞生長及侵襲。卵巢癌細胞中針對EGFR 的靶向治療的主要方法包含阻斷EGFR 結合配體，減少自身磷酸化，降低二聚體形成而阻斷信號向細胞核內傳遞，其次是使用EGFR抑制劑，通過減少EGFR 激酶上腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結合點結合，影響靶基因的轉錄及蛋白表達，減少卵巢癌細胞侵襲、轉移及血管生成。AG1478 作為新型EGFR 抑制劑，能夠通過干擾腫瘤細胞信號轉導，競爭性與ATP 結合區結合，減少EGFR 表達，減少轉導信號傳入從而引起一系列細胞生物學行為改變而發揮抑癌作用。以往文獻證實，體外胃癌細胞實驗采用不同濃度的AG1478干預后胃癌細胞生物學行為侵襲及遷移能力降低，凋亡加劇，與依賴性抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路上調叉頭框蛋白O3a（forkhead box O3a，FOXO3a）信號通路發揮作用相關。劉粉霞等證實，AG1478 通過調節促凋亡基因增加細胞凋亡信號因子表達而增加胃癌細胞凋亡，降低侵襲及轉移能力。本研究中，與空白組相比，干預組CaOV-3細胞生長、侵襲能力減弱，凋亡提高，且具有時間劑量依賴性，說明AG1478 對卵巢癌細胞生長及侵襲具有抑制作用，機制可能與EGFR 信號活性抑制后伴隨PI3K/AKT 信號及Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導及轉錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）、磷脂酶Cγ（phospholipase C-γ，PLC-γ）下游因子信號失活，信號轉導阻礙，導致細胞增殖減慢，細胞凋亡信號通路表達活躍而加快卵巢癌細胞凋亡有關。

PAI-1 是纖溶過程調節因子，表達增加能夠導致血栓性疾病及惡性腫瘤疾病。卵巢癌細胞中PAI-1 陽性表達升高，外源性轉染后能夠提高卵巢癌細胞活性，增加轉移能力，且臨床診斷中PAI-1與患者病理分期升高及發生轉移存在相關性，說明PAI-1 是檢測卵巢癌患者腫瘤轉移及預后的重要指標。uPAR 在卵巢癌細胞侵襲及轉移中發揮促進作用，能夠通過激活金屬蛋白酶降解卵巢癌細胞外基質，調節細胞活性。賀珊等證實，與癌旁組織相比，uPAR 在卵巢癌組織中表達水平升高，與腫瘤復發、分期及預后相關。PAI-1 和uPAR 在卵巢癌細胞中能夠特異性結合形成復合物，隨后發生降解出現細胞表面分布不均，能夠增加卵巢癌細胞增殖及浸潤能力。張孔雁等證實PAI-1 能夠與uPAR 上游因子uPA 結合，減少uPA 過度消化，起到促進作用。PAI-1 能夠減少卵巢癌組織降解，且參與血管生成作用。EGFR 信號與PAI-1 之間存在關聯，在國外研究中指出

EGFR

siRNA 阻斷PAI-1以及Raf-1 表達，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路通過PAI-1 的表達調節發揮抗疾病作用。Alberti 等證實，在血管破裂疾病中AG1478 抑制EGFR 信號轉導或引入激酶缺陷的EGFR 構建體可有效阻斷PAI-1 和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達，說明AG1478 具有抑制PAI-1 作用。本研究中，干預組細胞中PAI-1 和uPAR 蛋白及基因表達均降低，可能與AG1478抑制ERK 信號通路細胞信號轉導，抑制卵巢癌細胞生物學行為，調節凋亡信號通路相關，機制還需進一步研究。

本研究具有一定不足，實驗方法存在單一性，研究機制需要進一步完善，對實驗結果可能產生偏差，后期本課題組會增加樣本量，細化實驗內容，為卵巢癌臨床研究提供實踐依據。

綜上所述，EGFR 抑制劑AG1478 能夠有效降低卵巢癌CaOV-3細胞存活率及侵襲性，加快凋亡，這與阻礙PAI-1 和uPAR 信號通路表達相關。