基于高原低氧適應(yīng)性的藏雞胚胎Hb分子表達(dá)分析

李倩

摘 要：藏雞具有良好的克服低氧損害、低氧適應(yīng)性能力?；陔u紅細(xì)胞生成與珠蛋白表達(dá)分析，選擇403只隱性白雞、111只藏雞為樣品，低氧環(huán)境分別選擇為13%氧含量、12%氧含量，采取全期低氧、階段性低氧模式，對(duì)上述2個(gè)品種雞的血紅蛋白突變、位點(diǎn)等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果表明：藏雞對(duì)低氧適應(yīng)能力較強(qiáng)，在低氧環(huán)境誘導(dǎo)下，藏雞胚胎的珠蛋白量增加。

關(guān)鍵詞：高原低氧適應(yīng)性;藏雞胚胎;Hb分子

中圖分類號(hào)：S831.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2021）7-0018-04

藏雞是青藏高原地區(qū)特有的原始雞種，多分布于海拔高度為2200～4100m的區(qū)域[1]。因藏雞生長(zhǎng)過程中，長(zhǎng)期面對(duì)低氧環(huán)境，所以藏雞在其機(jī)體、生理等方面構(gòu)建了較強(qiáng)的適應(yīng)能力機(jī)制。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)以雞紅細(xì)胞生成與珠蛋白表達(dá)為切入點(diǎn)，選取藏雞、隱性白雞2個(gè)雞品種的胚胎進(jìn)行低氧環(huán)境試驗(yàn)，以進(jìn)一步探討藏雞高原低氧適應(yīng)的Hb（Hemoglobin，血紅蛋白）分子機(jī)制。

1 雞紅細(xì)胞生成與珠蛋白表達(dá)

脊椎動(dòng)物的造血位點(diǎn)根據(jù)造血干細(xì)胞群的變化而變化;哺乳動(dòng)物的造血位點(diǎn)順序?yàn)槁腰S囊、胎兒肝臟、脾、成年骨髓。但雞不以胎兒肝臟為造血器官，在骨髓形成前，在卵黃囊、腸系膜中生成血細(xì)胞。具體而言，雞胚胎在發(fā)育的第3～5天，造血位點(diǎn)在主動(dòng)脈的腹壁上;第6～8天，造血祖細(xì)胞在葉間細(xì)胞中分部[1]。

在雞胚胎發(fā)育過程中，α族、β族珠蛋白受到嚴(yán)格調(diào)控，胚胎發(fā)育早期，π、ρ、ε珠蛋白基因表達(dá)，其他基因沉默;胚胎發(fā)育后期，珠蛋白表達(dá)方式與胚胎發(fā)育早期的珠蛋白表達(dá)相反[2]。基于高原低氧環(huán)境，雞胚胎在不同發(fā)育階段的表達(dá)是否能夠表現(xiàn)出適應(yīng)性調(diào)控，需要對(duì)藏雞胚胎的高原低氧適應(yīng)性的Hb分子機(jī)制進(jìn)行探討。

2 材料與方法

2.1 樣品來源與低氧孵化模擬

2.1.1 樣品來源 實(shí)驗(yàn)雞選擇隱性白雞（白羽肉雞）和藏雞，隱性白雞的種蛋來源于中國(guó)農(nóng)大種雞場(chǎng)，共計(jì)403個(gè);藏雞的種蛋來源兩個(gè)群體，35個(gè)來自中國(guó)農(nóng)大種雞場(chǎng)，76個(gè)來自西藏不同海拔地區(qū)的混合群體。

2.1.2 低氧孵化模擬 孵化全程采用低氧、階段低氧兩種方式進(jìn)行，對(duì)隱性白雞、藏雞種蛋進(jìn)行同時(shí)孵化，低氧孵化時(shí)的氧氣濃度為13%、12%，溫度控制為37.5 ℃左右，濕度控制在61%左右，翻蛋次數(shù)為1次/2 h[2]。同時(shí)，低氧環(huán)境下，不對(duì)種蛋進(jìn)行開箱照蛋處理，21 d后，鑒定雞胚胎死亡日齡。全程低氧環(huán)境下藏雞種蛋數(shù)為76個(gè)，隱性白雞種蛋數(shù)為233個(gè);階段低氧環(huán)境下藏雞種蛋數(shù)為119個(gè)，隱性白雞種蛋數(shù)為152個(gè)。

2.2 溶液制備

溶液制備包括：0.5M EDTA試劑、50×TAE緩沖液、10×TBE緩沖液等;RNA提取試劑包括：0.1%的DEPC處理水、70%與75%的乙醇、水飽和酶等[2]。

2.3 血氧飽和度測(cè)定

第14天時(shí)，對(duì)雞胚胎進(jìn)行采血測(cè)驗(yàn)，血液采自尿囊靜脈，采血時(shí)間控制在5 min內(nèi)，并應(yīng)用肝素鈉抗凝。

基于SWISS-MODEL蛋白預(yù)測(cè)服務(wù)器完成突變血紅蛋白三級(jí)與四級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，并對(duì)血氧飽和度數(shù)據(jù)、珠蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[2]。

3 結(jié)果與分析

3.1 根據(jù)全期低氧的試驗(yàn)分析

總結(jié)出76個(gè)藏雞和233個(gè)隱性白雞的種蛋在氧氣濃度為13%環(huán)境下死亡個(gè)數(shù)、孵化個(gè)數(shù)（21 d）;35個(gè)藏雞和170個(gè)只隱性白雞的種蛋在氧氣濃度為12%的環(huán)境下的死亡個(gè)數(shù)、孵化個(gè)數(shù)（21 d），具體如表1所示。

為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性，各階段的藏雞、隱性白雞的種雞數(shù)量設(shè)置有所不同，藏雞、隱性白雞胚胎在氧氣濃度為12%的環(huán)境下的階段存活率、孵化率（21 d）具體如表2所示。

從表1、表2分析可知，海拔越高，隱性白雞比藏雞的死亡幅度越大，低氧耐受能力越差。在全期低氧環(huán)境下，13%的氧氣濃度下隱性白雞的孵化率為3.1%;12%的氧氣濃度下，藏雞也無法適應(yīng)，孵化率只有11.3%。同時(shí)，根據(jù)卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)，各階段與品種因素內(nèi)各水平間不顯著（P>0.05）;而孵化率方面，不同品種間差異顯著，但低氧階段間差異不顯著（P>0.05） [2-3]。

3.2 Hb突變位點(diǎn)檢測(cè)

針對(duì)存活的隱性白雞、藏雞的血紅蛋白突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，隱性白雞中未檢測(cè)到突變，藏雞α鏈存在突變Met-32D（B13）-Leu[4]。通過對(duì)其蛋白質(zhì)序列分析，預(yù)測(cè)其血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)。圖1為藏雞血紅蛋白β珠蛋白的突變及其相鄰氨基酸示意圖;圖2為接觸點(diǎn)位示意圖;圖3為藏雞血紅蛋白階段表達(dá)譜示意圖。

由圖2分析可知，藏雞的兩個(gè)血紅蛋白接觸位點(diǎn)的兩個(gè)氨基酸之間的距離，根據(jù)范德華力作用距離，該突變產(chǎn)生較弱的范德華力作用，突變位點(diǎn)Ile-55H（D6）-Leu處于同一螺旋的突變Ala-51H（D2）-Pro發(fā)生于分子表面，未發(fā)生新的分子作用力變化。

從圖3可以看出雞胚中有7種血紅蛋白（HbA、HbD、HbP、HbM、HbE、HbL、HbH），左圖中顯示各珠蛋白轉(zhuǎn)換效率差異性大，Alpha A在種雞孵化第3天時(shí)，珠蛋白百分比為85.69%;在孵化第18天時(shí)，珠蛋白百分比為26.75%，在低氧環(huán)境下，珠蛋白將直接影響血紅蛋白百分比。從圖3右圖分析可知，在種雞孵化第4天時(shí)，Hbp的血紅蛋白百分比為14.85%;孵化第8天后，逐漸趨于0，這與常氧環(huán)境下種雞孵化相比，血紅蛋白組合出現(xiàn)巨大差異。同時(shí)右圖中，胚胎中的HbE血紅蛋白百分比為90%，超過其他種類血紅蛋白含量，因此，HbE成為藏雞胚胎的主要血紅蛋白[5]。

4 討論

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，在全期低氧情況下，藏雞的死亡集中于12 d以后，表明藏地的低氧高適應(yīng)性表現(xiàn)為4～11 d。階段性低氧情況下，藏雞的孵化率為80%以上，與常氧下的孵化率相近。同時(shí)，藏雞的低氧損害后期恢復(fù)能力較強(qiáng)，孵化率較高。另外，藏雞胚胎血紅蛋白的7個(gè)亞基分析可知，藏雞胚胎的基因頻率越高，孵化率越高，因此可以認(rèn)為基因的突變是一種低氧適應(yīng)性能力的突變[6]。除此之外，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，藏雞的珠蛋白突變，有效提升了其血紅蛋白的氧親和力以及血液的氧親和力，進(jìn)而表現(xiàn)出藏雞胚胎對(duì)低氧的高適應(yīng)能力。由于血紅蛋白在與氧結(jié)合的過程中，可以通過變構(gòu)，使β鏈、H螺旋靠近，以增強(qiáng)血紅蛋白釋放的氧量，維持組織需要[6]。但在藏雞胚胎中，球蛋白變異與人類的血紅蛋白HbF變異相似，保證了藏雞胚胎在低氧環(huán)境中，具有較高的血氧親和力[6]。在低氧誘導(dǎo)下，藏雞胚胎的珠蛋白基因表達(dá)受到抑制。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，藏雞胚胎孵化率隨著海拔的升高顯著性逐漸降低，氧氣含量為12%的低氧環(huán)境中，藏雞胚胎低氧適應(yīng)性不強(qiáng)，孵化率為11.3%。結(jié)合全期低氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藏雞低氧死亡集中于12 d以后。同時(shí)，在12%氧氣含量的低氧環(huán)境誘導(dǎo)下，藏雞胚胎的珠蛋白表達(dá)增加，使血紅蛋白量增加。另外，在血紅蛋白功能位點(diǎn)方面，HbP的血氧親和力最強(qiáng)，HIF-1α直接參與紅細(xì)胞轉(zhuǎn)換、珠蛋白低氧開關(guān)機(jī)制調(diào)控。

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Analysis of Hb Molecular Expression in Tibetan Chicken Embryos Based on High Altitude Hypoxia Adaptability

LI Qian

（College of Preparatory Education， Qinghai University for Nationalities，

Xining 810000， China）

Abstract： Tibetan chicken has a good ability to overcome hypoxia damage and adaptability.Based on the analysis of chicken erythropoiesis and globin expression， 403 recessive white chickens and 111 Tibetan chickens were selected as samples. The hypoxic environment was selected as 13% oxygen content and 12% oxygen content， respectively. Total hypoxia and phased hypoxia were adopted. Model， experimental analysis of hemoglobin mutations and loci of two breeds of chickens.The results show that Tibetan chickens have a strong ability to adapt to hypoxia. Under the induction of hypoxia， the globin content of Tibetan chicken embryos increases.

Keywords： Plateau hypoxia adaptability; Tibetan chicken embryo; Hb molecules