基于高原低氧適應性的藏雞胚胎Hb分子表達分析

李倩

摘 要：藏雞具有良好的克服低氧損害、低氧適應性能力。基于雞紅細胞生成與珠蛋白表達分析，選擇403只隱性白雞、111只藏雞為樣品，低氧環境分別選擇為13%氧含量、12%氧含量，采取全期低氧、階段性低氧模式，對上述2個品種雞的血紅蛋白突變、位點等進行實驗分析。結果表明：藏雞對低氧適應能力較強，在低氧環境誘導下，藏雞胚胎的珠蛋白量增加。

關鍵詞：高原低氧適應性;藏雞胚胎;Hb分子

中圖分類號：S831.2 文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2021）7-0018-04

藏雞是青藏高原地區特有的原始雞種，多分布于海拔高度為2200～4100m的區域[1]。因藏雞生長過程中，長期面對低氧環境，所以藏雞在其機體、生理等方面構建了較強的適應能力機制。據此，本實驗以雞紅細胞生成與珠蛋白表達為切入點，選取藏雞、隱性白雞2個雞品種的胚胎進行低氧環境試驗，以進一步探討藏雞高原低氧適應的Hb（Hemoglobin，血紅蛋白）分子機制。

1 雞紅細胞生成與珠蛋白表達

脊椎動物的造血位點根據造血干細胞群的變化而變化;哺乳動物的造血位點順序為卵黃囊、胎兒肝臟、脾、成年骨髓。但雞不以胎兒肝臟為造血器官，在骨髓形成前，在卵黃囊、腸系膜中生成血細胞。具體而言，雞胚胎在發育的第3～5天，造血位點在主動脈的腹壁上;第6～8天，造血祖細胞在葉間細胞中分部[1]。

在雞胚胎發育過程中，α族、β族珠蛋白受到嚴格調控，胚胎發育早期，π、ρ、ε珠蛋白基因表達，其他基因沉默;胚胎發育后期，珠蛋白表達方式與胚胎發育早期的珠蛋白表達相反[2]。基于高原低氧環境，雞胚胎在不同發育階段的表達是否能夠表現出適應性調控，需要對藏雞胚胎的高原低氧適應性的Hb分子機制進行探討。

2 材料與方法

2.1 樣品來源與低氧孵化模擬

2.1.1 樣品來源 實驗雞選擇隱性白雞（白羽肉雞）和藏雞，隱性白雞的種蛋來源于中國農大種雞場，共計403個;藏雞的種蛋來源兩個群體，35個來自中國農大種雞場，76個來自西藏不同海拔地區的混合群體。

2.1.2 低氧孵化模擬 孵化全程采用低氧、階段低氧兩種方式進行，對隱性白雞、藏雞種蛋進行同時孵化，低氧孵化時的氧氣濃度為13%、12%，溫度控制為37.5 ℃左右，濕度控制在61%左右，翻蛋次數為1次/2 h[2]。同時，低氧環境下，不對種蛋進行開箱照蛋處理，21 d后，鑒定雞胚胎死亡日齡。全程低氧環境下藏雞種蛋數為76個，隱性白雞種蛋數為233個;階段低氧環境下藏雞種蛋數為119個，隱性白雞種蛋數為152個。

2.2 溶液制備

溶液制備包括：0.5M EDTA試劑、50×TAE緩沖液、10×TBE緩沖液等;RNA提取試劑包括：0.1%的DEPC處理水、70%與75%的乙醇、水飽和酶等[2]。

2.3 血氧飽和度測定

第14天時，對雞胚胎進行采血測驗，血液采自尿囊靜脈，采血時間控制在5 min內，并應用肝素鈉抗凝。

基于SWISS-MODEL蛋白預測服務器完成突變血紅蛋白三級與四級結構的預測，并對血氧飽和度數據、珠蛋白表達數據進行分析[2]。

3 結果與分析

3.1 根據全期低氧的試驗分析

總結出76個藏雞和233個隱性白雞的種蛋在氧氣濃度為13%環境下死亡個數、孵化個數（21 d）;35個藏雞和170個只隱性白雞的種蛋在氧氣濃度為12%的環境下的死亡個數、孵化個數（21 d），具體如表1所示。

為保證實驗的可靠性，各階段的藏雞、隱性白雞的種雞數量設置有所不同，藏雞、隱性白雞胚胎在氧氣濃度為12%的環境下的階段存活率、孵化率（21 d）具體如表2所示。

從表1、表2分析可知，海拔越高，隱性白雞比藏雞的死亡幅度越大，低氧耐受能力越差。在全期低氧環境下，13%的氧氣濃度下隱性白雞的孵化率為3.1%;12%的氧氣濃度下，藏雞也無法適應，孵化率只有11.3%。同時，根據卡方獨立性檢驗，各階段與品種因素內各水平間不顯著（P>0.05）;而孵化率方面，不同品種間差異顯著，但低氧階段間差異不顯著（P>0.05） [2-3]。

3.2 Hb突變位點檢測

針對存活的隱性白雞、藏雞的血紅蛋白突變位點進行檢測，隱性白雞中未檢測到突變，藏雞α鏈存在突變Met-32D（B13）-Leu[4]。通過對其蛋白質序列分析，預測其血紅蛋白的三維結構。圖1為藏雞血紅蛋白β珠蛋白的突變及其相鄰氨基酸示意圖;圖2為接觸點位示意圖;圖3為藏雞血紅蛋白階段表達譜示意圖。

由圖2分析可知，藏雞的兩個血紅蛋白接觸位點的兩個氨基酸之間的距離，根據范德華力作用距離，該突變產生較弱的范德華力作用，突變位點Ile-55H（D6）-Leu處于同一螺旋的突變Ala-51H（D2）-Pro發生于分子表面，未發生新的分子作用力變化。

從圖3可以看出雞胚中有7種血紅蛋白（HbA、HbD、HbP、HbM、HbE、HbL、HbH），左圖中顯示各珠蛋白轉換效率差異性大，Alpha A在種雞孵化第3天時，珠蛋白百分比為85.69%;在孵化第18天時，珠蛋白百分比為26.75%，在低氧環境下，珠蛋白將直接影響血紅蛋白百分比。從圖3右圖分析可知，在種雞孵化第4天時，Hbp的血紅蛋白百分比為14.85%;孵化第8天后，逐漸趨于0，這與常氧環境下種雞孵化相比，血紅蛋白組合出現巨大差異。同時右圖中，胚胎中的HbE血紅蛋白百分比為90%，超過其他種類血紅蛋白含量，因此，HbE成為藏雞胚胎的主要血紅蛋白[5]。

4 討論

結合上述實驗結果分析，在全期低氧情況下，藏雞的死亡集中于12 d以后，表明藏地的低氧高適應性表現為4～11 d。階段性低氧情況下，藏雞的孵化率為80%以上，與常氧下的孵化率相近。同時，藏雞的低氧損害后期恢復能力較強，孵化率較高。另外，藏雞胚胎血紅蛋白的7個亞基分析可知，藏雞胚胎的基因頻率越高，孵化率越高，因此可以認為基因的突變是一種低氧適應性能力的突變[6]。除此之外，結合實驗結果，藏雞的珠蛋白突變，有效提升了其血紅蛋白的氧親和力以及血液的氧親和力，進而表現出藏雞胚胎對低氧的高適應能力。由于血紅蛋白在與氧結合的過程中，可以通過變構，使β鏈、H螺旋靠近，以增強血紅蛋白釋放的氧量，維持組織需要[6]。但在藏雞胚胎中，球蛋白變異與人類的血紅蛋白HbF變異相似，保證了藏雞胚胎在低氧環境中，具有較高的血氧親和力[6]。在低氧誘導下，藏雞胚胎的珠蛋白基因表達受到抑制。

5 結論

本試驗結果顯示，藏雞胚胎孵化率隨著海拔的升高顯著性逐漸降低，氧氣含量為12%的低氧環境中，藏雞胚胎低氧適應性不強，孵化率為11.3%。結合全期低氧實驗結果表明，藏雞低氧死亡集中于12 d以后。同時，在12%氧氣含量的低氧環境誘導下，藏雞胚胎的珠蛋白表達增加，使血紅蛋白量增加。另外，在血紅蛋白功能位點方面，HbP的血氧親和力最強，HIF-1α直接參與紅細胞轉換、珠蛋白低氧開關機制調控。

參考文獻：

[1] 商鵬， 董亞南， 朱新海，等. 藏雞育種研究現狀及建議[J]. 中國家禽， 2019， 41（01）：45-49.

[2] 張瑩， 張戌園， 張浩，等. 轉鐵蛋白基因表達與低氧適應[J]. 中國家禽， 2019（22）：5-8.

[3] 王志敏， 徐亞歐， 楊磊，等. 不同海拔地區藏雞生理生化指標的研究[J]. 畜牧與飼料科學， 2018， 39（02）：1-7.

[4] 賈騰飛. 藏雞高原低氧環境適應機制的研究進展[J]. 畜禽業， 2018， 29（12）：15-18.

[5] 張紅亮， 張浩. 藏雞低氧適應研究進展[J]. 中國家禽， 2018， 40（08）：47-52.

[6] 唐曉惠， 強巴央宗. 藏雞對高原低氧環境適應性的研究現狀與展望[J]. 中國家禽， 2015， 37（18）：1-4.

Analysis of Hb Molecular Expression in Tibetan Chicken Embryos Based on High Altitude Hypoxia Adaptability

LI Qian

（College of Preparatory Education， Qinghai University for Nationalities，

Xining 810000， China）

Abstract： Tibetan chicken has a good ability to overcome hypoxia damage and adaptability.Based on the analysis of chicken erythropoiesis and globin expression， 403 recessive white chickens and 111 Tibetan chickens were selected as samples. The hypoxic environment was selected as 13% oxygen content and 12% oxygen content， respectively. Total hypoxia and phased hypoxia were adopted. Model， experimental analysis of hemoglobin mutations and loci of two breeds of chickens.The results show that Tibetan chickens have a strong ability to adapt to hypoxia. Under the induction of hypoxia， the globin content of Tibetan chicken embryos increases.

Keywords： Plateau hypoxia adaptability; Tibetan chicken embryo; Hb molecules