人結直腸癌組織Claudin-1、Claudin-7 蛋白的表達與患者預后的關系

曹躍鵬，袁旦平，龐洪雙，趙振亞，李璐，陶勇

結直腸癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居所有惡性腫瘤發病率的第3 位，死亡率位居第2 位[1]。關于結直腸癌惡性生物學行為的分子生物學機制尚不十分清楚,但普遍認為其涉及多基因、多步驟的調控過程。隨著研究的深入，已有研究表明細胞間連接結構的破壞損傷及細胞間黏附力的減低或喪失與腫瘤的發生、浸潤及轉移密切相關[2]。因此，緊密連接蛋白基因家族成為研究的熱點與難點。多項研究表明，Claudin 蛋白是緊密連接的主要組成成分，尤其是Claudin-1 及Claudin-7 在細胞的異常增生、腫瘤的發生及發展等方面起著重要的作用[3-4]。目前，其在結直腸癌中的表達及作用研究有限，無明確論斷。本研究采用免疫組織化學（免疫組化）檢測結直腸癌患者癌組織和癌旁組織中Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達，結合患者的臨床及隨訪資料，旨在分析結直腸癌組織Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達以及與患者預后的關系。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012 年1 月至2016 年1 月寧波市第一醫院肛腸外科收治的行手術切除并經病理證實的88例結直腸癌患者的術后標本及其基本臨床資料。其中男51例，女37例；年齡41～79 歲，平均年齡（60.3±18.1）歲；結腸癌49例，直腸癌39例。所有患者均排除心、肝、腎等重要器官疾病，無合并嚴重內科疾病，無其他部位原發腫瘤及轉移瘤。所有病例術前均未經任何抗腫瘤治療，術后對所有患者進行隨訪，隨訪終止時間為2021 年1 月。研究的主要終點事件為總生存時間（OS），其定義為手術之日至出現任何原因引起的死亡時間或隨訪終止，非腫瘤相關性死亡歸為失訪。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料 兔抗人Claudin-1 多克隆抗體（上海煊翎生物科技有限公司）；兔抗人Claudin-7 多克隆抗體（上海煊翎生物科技有限公司）；免疫組化試劑盒（上海煊翎生物科技有限公司）；DAB（氨基聯苯胺）顯色試劑盒（濃縮型）：北京西雅金橋生物技術公司。所需標本均用4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，取出浸泡于95%乙醇中的清潔載玻片，涂布多聚賴氨酸干燥后制作4m厚度組織切片，行免疫組化染色。

1.2.2 免疫組化（LP法）88例配對的癌組織及癌旁組織標本，經常規脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液高溫修復抗原，PBS 漂洗3 次后以0.3%過氧化氫-甲醇孵育10 min，清除內源性的過氧化物酶活性，PBS漂洗4 次后滴加5%BSA 封閉液，室溫孵育60 min 傾去，滴加適當比例稀釋的一抗，冰箱4 ℃過夜。PBS 漂洗3 次后，再滴加二抗，室溫孵育20 min；PBS 漂洗3 次，再滴加試劑SABC 室溫孵育20 min；PBS 漂洗4 次，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS 代替-抗作陰性對照。結果判斷：在10 個高倍顯微鏡下觀察，以細胞膜和/或細胞質中出現黃棕色著色顆粒或團塊為 Claudin-1 及Claudin-7 陽性細胞。低表達為陽性細胞數＜10%；高表達為陽性細胞數≥10%。

1.3 統計方法 運用SPSS 15.0 統計軟件進行分析，Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達與結直腸癌患者的臨床病理參數的關系采用2檢驗。采用法計算生存率，以法檢測生存曲線的差異。采用單因素及多因素回歸分析法分析Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達與患者預后的關系。＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織及癌旁不同距離組織中Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達的比較 Claudin-1及Claudin-7 蛋白陽性黃褐色顆粒主要分布在細胞膜或細胞質中（封二彩圖1～4）。Claudin-1 蛋白在癌旁組織中呈高表達22.72%（20/88），在結直腸癌組織中高表率達80.68%（71/88）；Claudin-7 蛋白在癌旁組織中高表達90.91%（80/88），在結直腸癌組織中低表達率達45.45%（40/88）；差異均有統計學意義（2=59.18、29.33，均＜0.05）。

2.2 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達與結直腸癌患者的浸潤深度、分化程度、淋巴轉移、TNM 分期均有關（均＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小及位置、血清CEA 等均無關（均＞0.05），見表1。

表1 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 例

2.3 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達與結直腸癌患者的生存分析 隨訪10～60（中位數43）個月，其中失訪11例（包括非腫瘤相關死亡病例）。Claudin-1蛋白陽性表達組與Claudin-7 蛋白陰性表達組5 年總生存率分別為27.91%（19例）與49.86%（8例），差異有統計學意義（2=9.59＜0.05）。Claudin-7蛋白陽性表達組與Claudin-7 蛋白陰性表達組5 年總生存率分別為48.70%（23例）與27.90%（10例），差異有統計學意義（2=8.70＜0.05），見封二彩圖5～6。

2.4 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達與結直腸癌患者的影響因素分析 Cox 回歸模型單因素及多因素顯示，TNM 分期晚、浸潤程度深、淋巴結轉移和Claudin-1 蛋白陽性表達及Claudin-7 蛋白陰性表達均是結直腸癌患者術后總生存期的獨立高危因素（均＜0.05）。見表2。

表2 結直腸癌患者總生存預后影響因素的預后分析

3 討論

結直腸癌是全球死亡率較高的惡性腫瘤。盡管對于結直腸癌的發病機制的研究已經取得了較好的進展；但要闡明其分子機制仍然有大量的工作需要完成，而分析結直腸癌組織與正常組織中的蛋白表達水平差異是研究其發病機制的重要途徑之一。Claudin 包含NH2-和COOH-端位于細胞內部，C 末端可與內層的蛋白分子連接；細胞外的肽鏈可以形成兩個跨膜的環，這兩個環可以和鄰近的其他細胞的同種類型環相接觸而行使功能[5]。現已證實，Claudin 蛋白是構成緊密連接的骨架蛋白，參與維持細胞極性和滲透性，黏膜屏障及信號傳導功能，其功能改變與多種腫瘤發生密切相關[6]。

結直腸癌與Claudin 緊密連接蛋白是近年來研究的熱點，其異常表達可能參與結直腸癌發生發展及轉移的過程。大量證據表明，由于組織特異性不同，Claudin 種類在癌組織中表達量也不同[7]。本研究從臨床表型入手，以較大的樣本量（88例結直腸癌患者臨床組織），通過免疫組化實驗方法分析Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達情況。本文結果表明Claudin-1 在癌組織中高表達，而Claudin-7 處于低表達。本研究免疫組化實驗結果顯示陽性黃褐色顆粒主要分布在細胞膜或細胞質中。對比患者的臨床信息后發現，Claudin 蛋白更多地與腫瘤浸潤轉移相關，提示Claudin蛋白可能通過改變細胞間黏附力，促使腫瘤細胞極性的生長失控。因此，本研究也嘗試用臨床資料來分析Claudin 蛋白與腫瘤進展及預后的關系；結果顯示，Claudin-1 蛋白高表達及Claudin-7 蛋白低表達與分化程度、淋巴結轉移、TNM分期及浸潤程度相關，說明該蛋白與結直腸癌惡性程度相關。目前認為，在腸癌組織中Claudin-1過表達機制的研究中發現，其表達可使E-鈣黏連蛋白受抑制，從而使-catenin 蛋白/T 細胞特異性轉錄因子信號通路表達上調，促使腫瘤的發生、發展[8]。亦有研究顯示，Claudin-1 過表達能明顯誘導基質金屬蛋白酶-2（MMP-2），引起緊密連接蛋白結構和功能破壞，導致組織黏附力下降或黏附分子破壞。繼而使腫瘤細胞易脫離原發灶，黏附于周圍間質或正常細胞基膜、血管、淋巴管。腫瘤細胞遷涉力侵襲力增加促進腫瘤浸潤，最終導致淋巴結轉移[9]。此外，在腫瘤組織中Claudin-7蛋白表達水平降低或不表達，與發生腫瘤時，緊密連接結構破壞，細胞間黏附性降低或丟失，失去限制腫瘤細胞的營養和相關生長因子供應的作用，而使腫瘤細胞缺乏分化，侵襲力增強[10]。Claudin-7 蛋白的表達下調促進上皮-間質轉化，并促進腫瘤的進展[11]。因此，其可能是結直腸癌的一種潛在的抑制劑。

本研究結合Cox 回歸分析顯示，Claudin-1 高表達及Claudin-7 低表達是結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素。另有研究顯示Claudin-1 水平的升高與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤復發顯著相關，是影響總體存活率的獨立預后因素，可作為潛在的預后因素[12]。Philip 等[13]研究發現，Claudin-7 表達和調控，與侵襲、轉移和上皮-間質轉化之間的相關性，參與結直腸癌進展，影響預后[13]。本研究中，筆者還對Claudin-1 及Claudin-7的表達強度與結直腸癌生存時間的關系進行了觀察分析，結果顯示Claudin-1 蛋白高表達組與Claudin-7 蛋白低表達組5 年總生存率分別為27.91%和49.86%，且差異有統計學意義（?＜0.05）。相反，Claudin-7 蛋白陽性表達組與Claudin-7 蛋白陰性表達組5 年總生存率分別為48.70%與27.90%，差異有統計學意義（?＜0.05）。

綜上所述，Claudin-1 高表達及Claudin-7 低表達可以促進結直腸癌的發生發展，與結直腸癌的侵襲和轉移有關，并影響患者預后，對判斷手術后結直腸癌患者預后具有較好的參考價值。