川芎嗪對膿毒癥小鼠肝臟的保護作用研究

張益維，王玨，朱浩，黃長順，楊秋紅，韓楊楊

膿毒癥是感染、創傷及燒傷等臨床危急重癥患者的常見并發癥，已成為危重病患者死亡的首要原因[1]。肝臟在膿毒癥的發生、發展中發揮著至關重要的調節作用[2]，肝細胞在膿毒癥時可以迅速地清除機體過量的炎癥介質，從而有效地調控機體的炎癥反應[3]。研究表明，肝功能障礙或肝臟病變的患者發生感染性疾病如膿毒癥等的風險明顯增加[4]，膿毒癥休克患者并發肝功能障礙者病死率高達84.0%[5]。川芎嗪已被證實對機體免疫系統具有調節作用，減少脂質過氧化物的生成等作用[6]。本研究旨在通過動物實驗觀察川芎嗪對膿毒癥小鼠肝臟的保護作用。報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型和分組 32 只試驗用小鼠，均為雄性8 周齡野生型C57BL/6J小鼠，體質量19～22 g，采購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，合格證號：20170005013227。按體質量編號后采用隨機數字表法分為4組，分別為假手術+0.9%氯化鈉注射液組（A 組）、假手術+川芎嗪組（B 組）、腸穿孔術（CLP）+0.9%氯化鈉注射液組（C 組）和CLP+川芎嗪組（D 組），各8 只小鼠。本試驗已通過杭州赫貝科技有限公司試驗動物倫理委員會的倫理審查。

1.2 方法 CLP 造模方法：所有小鼠于手術前12 h 禁食、禁水，采用4%水合氯醛（0.1 ml/10g）麻醉后，C、D組小鼠于腹中線處進行1 cm 左右的開口，游離盲腸，并于末端進行結扎，采用16號針在盲腸末端0.5cm處，穿刺并擠出少許糞便后縫合。A、B組小鼠只進行開腹不結扎盲腸。所有小鼠在開腹后均注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液。干預措施：B、D 組小鼠于術前30min 小鼠尾靜脈注射20mg/kg的鹽酸川芎嗪注射液，A、C 組小鼠于術前30 min 注射等量的0.9%氯化鈉注射液。

1.3 觀察指標（1）觀察4 組小鼠術后7 d 存活率。（2）血液生化檢測。取術后48 h眼眶血，EDTA抗凝處理后，4 ℃，5 000 r/min 離心10 min，取血漿置入血生化儀檢測丙氨酸氨基轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素-6（IL-6）。（3）采用ELISA 法檢測肝組織勻漿中IL-6 和TNF-表達，以及肝組織內髓過氧化物酶（MPO）的活性。（4）鏡下觀察拍照，對樣本的病理變化作綜合性描述，并對樣本進行病理評分。按炎細胞浸潤范圍評分：0分，無炎細胞或極少數炎細胞浸潤；1 分，＜25%，輕微炎癥；2 分，26%～50%，輕度炎癥；3 分，51%～75%，中度炎癥；4 分，＞75%，重度炎癥。以5 個視野的平均值作為該樣本的最終評分，最終結果以均數±標準差來表示。

1.4 統計方法 數據采用SPSS 22.0 軟件分析，計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用檢驗，多重比較采用 檢驗；生存率比較采用檢驗。＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術后7 d生存率比較 A、B組小鼠CLP 術后7 d 內無死亡，生存率顯著高于C 組和D 組（2≥5.02，均＜0.05）；D 組術后7 d 生存率顯著高于C 組（2=9.21＜0.05）。見封二彩圖7。

2.2 4 組小鼠術后7 d 生化指標和炎癥因子檢測 B組小鼠ALT、AST、TNF-、IL-1 及IL-6 均顯著低于A 組（≥5.22，均＜0.05）；C 組小鼠上述指標均顯著高于A 組（≥4.90，均＜0.05）；D 組小鼠上述指標均顯著低于A、C 兩組（≥4.68，均＜0.05），除TNF-外，其余指標均顯著高于B 組（≥4.41，均＜0.05）。見表1。

表1 4 組小鼠術后7 d 生化指標和炎癥因子檢測

2.3 4 組小鼠肝組織IL-6、TNF-及MPO 表達比較 B 組與A 組3 項指標差異均無統計學意義（≤1.20，均＞0.05）；C 組3 項指標均顯著高于B 組（≥4.11，均＜0.05）；D 組IL-6 及TNF-水平低于C 組（≥3.96，均＜0.05），MPO 水平差異無統計學意義（=1.85＞0.05）。見表2。

表2 4 組小鼠肝組織IL-6、TNF-及MPO 表達比較 pg/ml

2.4 病理結果（1）HE 染色結果示，A組及B 組小鼠肝細胞未見變形和壞死，肝竇清晰，未見炎癥浸潤。C 組小鼠肝細胞腫脹，中央靜脈存在嚴重變形，并伴有充血及炎癥細胞浸潤情況，肝臟大部分面積結構紊亂，給藥干預后（D 組）病理改變減輕。見封二彩圖8。（2）肝臟切片病理評分顯示，A組為輕微炎癥，評分為（0.07±0.25）分；B組為無炎癥；C 組為輕中度炎癥，評分為（2.20±0.75）分；D組為輕微炎癥，評分為（1.20±0.40）分。

3 討論

膿毒血癥多是感染或創傷引起的全身系統彌漫性炎癥反應[7]，在感染情況下，肝臟構成了宿主防御機制的一道重要屏障，肝細胞在膿毒癥時可以迅速地清除機體過量的炎癥介質，從而有效地調控機體的炎癥反應，在膿毒癥發生發展中起重要的作用[3]。川芎嗪是傘形科植物川芎根莖中的主要化學成分之一，為一種新型鈣離子拮抗劑。研究證實，川芎嗪具有抑制血小板聚集、降低血小板活性和抑制血管內皮細胞對纖溶酶原激活物抑的分泌及的表達[8]；對機體免疫系統具有重要的調節作用；同時還有擴張肺血管，阻斷內皮素受體，減少脂質過氧化物的生成等作用[6]，同時具有活血通脈作用[9]。這些藥理作用均可阻斷或減輕膿毒癥的病理生理過程，有利于膿毒癥的防治。

本研究結果表明，川芎嗪能夠提高CLP 小鼠7 d 生存率，猜測川芎嗪可能是通過保護肝臟改善抗炎反應和調節免疫的功能，來提高膿毒血癥小鼠術后的生存率。本研究結果表明，川芎嗪能夠有效保護CLP 小鼠肝功能，保護肝臟炎癥損害，調節免疫反應，采用川芎嗪的B組和D 組的ALT、AST、TNF-、IL-1 及IL-6 均顯著低于A 組和C 組；病理結果顯示，川芎嗪干預下的CLP 小鼠評分明顯低于對照組CLP小鼠評分，并且HE染色呈現類似結果，川芎嗪干預下的CLP小鼠肝臟炎性浸潤情況優于對照組。這與2009 年陳玉熹等[10]人的研究結果相似。

綜上所述，川芎嗪能夠通過調節CLP小鼠炎癥反應，抑制炎癥因子釋放，保護肝臟病理生理變化，從而避免膿毒血癥進行性加重，提高CLP小鼠術后7d 生存率，改善預后。