結締組織病伴膽汁淤積患者血清FGF19、Klotho 與肝組織FGFR4 蛋白表達的關系

張振，干敏芝，鄭小慶

結締組織病（CTDs）是一大類由自身免疫介導臟器損傷為特征的疾病總稱，其中有一部分CTDs 患者可合并有膽汁淤積性肝病（CLD）。2009 年歐洲肝臟研究學會（EASL）膽汁淤積專家共識建議堿性磷酸酶（ALP）水平高于1.5倍正常值范圍上限（ULN），并且谷氨酰轉肽酶（GT）水平高于3 倍ULN 可診斷膽汁淤積性肝病（CLD）[1]。成纖維細胞生長因子19（FGF19）可能在膽汁淤積的發生發展中發揮作用。本研究以結締組織病伴膽汁淤積患者為研究對象，通過測定患者血清FGF19、Klotho 蛋白水平并分析其與膽汁淤積及肝組織成纖維細胞生長因子受體4（FGFR4）表達程度的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年8 月至2020 年1 月中國科學院大學寧波華美醫院收治的結締組織病伴膽汁淤積患者40例（CTDs+CLD 組）。排除標準：妊娠哺乳期婦女、其他嚴重疾病如腫瘤、肝腎功能不全及血液系統疾病者。另選取結締組織病不伴膽汁淤積患者 40例（CTDs 組）、同期健康體檢者40例為健康對照組（Control 組）。本研究通過本院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 方法 詳細記錄入組患者臨床資料，包括性別、年齡、體質量、身高；實驗室指標，包括肝功能、抗核抗體（ANA）、抗線粒體抗體（AMA）、透明質酸（HA）及IV 型膠原（IV-C）。

1.2.1 血清FGF19、Klotho 水平檢測取清晨空腹靜脈血樣3 ml，自然凝固后離心收集上清標本儲存于－ 80℃冰箱內，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。試劑盒購自上海橋杜生物科技公司。

1.2.2 FGFR4 蛋白檢測 采取免疫組化方法，肝組織蠟塊經4 m 厚度切片，常規脫蠟和水化，采用3%過氧化氫溶液孵育10 min，經過蒸餾水洗3 次后，再使用PBS漂洗3 次；切片加1 滴第一抗體，4℃冰箱過夜，使用PBS洗3 次，DAB顯色后，充分水洗，蘇木素復染細胞核，再經水洗、脫水，使用中性樹酯封片，顯微鏡觀察。抗人FGFR4 多克隆抗體試劑盒由美國Santa Cruz 公司生產。每張切片由兩名病理科醫生進行計數，隨機選取5 個高倍鏡視野，觀察陽性細胞染色強度并計數陽性細胞百分率。根據染色強度（0 分：無染色；1 分：淡黃色；2 分：棕黃色；3 分：棕褐色）和陽性細胞百分數（0 分：＜5%；1 分：5%～25%；2 分：26%～50%；3 分：51%～75%；4 分：＞75%）進行評分，兩者相乘為最后得分，分為4 個等級：0～2 分為（－），3～5 分為（+），6～8 分為（2+），9～12 分為（3+）。

1.3 統計方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，采用兩組獨立樣本 檢驗；相關性分析采用Pearson檢驗；等級資料采用配對樣本Wilcoxon 秩和檢驗；等級資料間相關性分析采用Spearman秩相關分析。＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組一般資料比較 3 組年齡、性別、體質量及身高資料差異均無統計學意義（均＞0.05），具有可比性。CTDs+CLD 組FGF19 水平明顯高于CTDs 組、Control組（=6.779、7.075，均＜0.05），Klotho 水平低于CTDs 組、Control 組（=3.081、23.283，均＜0.05）。見表1。

表1 3 組一般資料比較

2.2 CTDs+CLD 組、CTDs 組實驗室指標比較 兩組ALP、GT、總膽汁酸、AMA抗體陽性率及IV型膠原差異均有統計學意義（均＜0.05），見表2。

表2 CTDs+CLD 組、CTDs 組實驗室指標的比較

2.3 結締組織病患者FGF19 與實驗室指標之間的相關性分析 FGF19 水平與ALP、GT、總膽汁酸水平呈正相關，與Klotho 呈負相關（均＜0.05）。見表3。

表3 結締組織病患者FGF19 與實驗室指標之間的相關性

2.4 CTDs+CLD 組FGF19 不同水平間FGFR4的表達 以FGF19 中位濃度（533 pg/ml）為界，將CTDs+CLD患者分為FGF19 高水平組和FGF19 低水平組，兩組FGFR4的表達差異有統計學意義（＜0.05）。見表4、封二彩圖9。

表4 FGF19 不同水平間FGFR4 表達的配對Wilcoxon 秩和檢驗 例

2.5 CTDs+CLD 患者FGFR4 水平和FGF19、Klotho 相關行分析 CTDs+CLD患者FGFR4 表達水平與FGF19 水平呈正相關（＜0.05）。見表5。

表5 FGFR4 表達與實驗室指標的Spearman 秩相關分析

3 討論

CTDs 合并CLD 臨床并不少見，CLD 癥狀程度卻差異較大，一部分患者因膽汁淤積癥狀輕微未引起重視，然而持續的膽汁淤積、膽管損傷和肝內炎癥可能逐步進展為肝纖維化、肝硬化和終末期肝病。FGF19 是FGF 家族中具有“激素樣FGFs”生物學特征的成員之一，其主要在回腸表達，而肝臟是FGF19 作用的主要靶器官[2]。FGF19 在Klotho 蛋白參與協助下與FGFR4 結合[3]，Klotho可使FGF19、FGFR4 之間相互作用的穩定性和親和力加強，FGF19 激活FGFR4后導致下游信號的活化[4]。腸道中的法呢醇X受體（FXR）發揮膽汁酸感應器的作用，可被膽酸和鵝脫氧膽酸激活，FXR激活后促進FGF19的表達[5]，腸道合成FGF19 增多，通過血流至肝臟[6]，FGF19與FGFR4 結合后誘導小異二聚體伴侶的表達，后者再與肝臟受體同源物1 結合，抑制膽固醇7 1 羥化酶（Cyp7 1）啟動子的活性，下調Cyp7 1的表達，Cyp7 1 是膽汁酸合成的關鍵酶，Cyp7 1 表達降低，膽酸合成減少，肝腸膽汁酸清除增加。FXR 激動劑奧貝膽酸（OCA）作為新型的鵝去氧膽酸衍生物可改善PBC 患者的膽汁淤積[7]。

本研究顯示與不伴CLD的CTDs患者比較，CLD組患者FGF19 水平明顯升高，Klotho 水平則下降。CLD 組患者具有更高的IV-C 及AMA 抗體陽性率。FGF19 水平與膽汁淤積程度呈正相關、與Klotho 水平呈負相關。血清Klotho蛋白即循環型Klotho，具有抗氧化、抗凋亡等生理作用，炎癥反應和氧化應激可下調Klotho的表達，推測CLD 患者中這種低水平的Klotho 可能進一步引起FGF19 水平升高，近年來已開展將Klotho 作為治療靶點的研究[8]。IV-C 是早期肝臟纖維化的敏感指標，提示對于CLD 患者，需定期監測肝臟纖維化的程度[9]，有體外實驗研究顯示 FGF19/FGFR4 信號通路具有抗纖維化作用[10]。Wunsch 等[11]發現在原發性膽汁性肝硬化（PBC）患者中FGF19 水平、FGFR4 表達均增加，認為FGF19 與PBC疾病的嚴重程度相關，可作為慢性膽汁淤積肝損傷的一個指標。本研究顯示CLD 患者中FGF19 高水平組和FGF19 低水平組間FGFR4 表達具有差異性，FGFR4 表達與FGF19 水平正相關，說明FGF19 發揮作用需要FGFR4的協同表達。CLD病例肝臟組織FGFR4 表達免疫組化得分多介于+～2+，無強陽性（3+）的病例。在針對各類腫瘤中FGFR4 表達的研究中，顯示在食道癌、肝癌[12]，甲狀腺癌[13]中FGFR4 表達顯著增高。