三氧預(yù)充回收自體血后的紅細(xì)胞流變學(xué)和功能變化研究

周燕琴，吳琴麗，高特生

術(shù)中回收自體血并回輸已廣泛應(yīng)用于心臟外科、大血管外科、骨科及婦產(chǎn)科等多個(gè)領(lǐng)域，在急性大出血的搶救、異體輸血并發(fā)癥的預(yù)防及節(jié)約血源方面均發(fā)揮了重要作用[1]。無論是洗滌式還是非洗滌式自體輸血，術(shù)中血液回收過程中由于自體血和管道的接觸、吸引器的吸引力作用、洗滌及離心等機(jī)械作用，紅細(xì)胞的破壞在所難免[2]。而紅細(xì)胞流變學(xué)和功能的變化，均可能導(dǎo)致紅細(xì)胞運(yùn)氧能力下降，甚至引發(fā)嚴(yán)重輸血后并發(fā)癥，影響手術(shù)安全性[3]。因此，在提高術(shù)中自體血回收率的基礎(chǔ)上，如何保護(hù)好紅細(xì)胞的質(zhì)量和功能，也是目前臨床關(guān)注的重點(diǎn)。三氧又稱臭氧，是由三個(gè)氧原子組成的強(qiáng)氧化劑，具有氧化、抗炎及鎮(zhèn)痛等作用，已在多種疾病和領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4]。最新研究顯示，三氧能夠提高紅細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）含量與2,3-二磷酸甘油（2,3-DPG）水平[5]，故采取三氧預(yù)充回收自體血有望提高紅細(xì)胞質(zhì)量，延長安全保存時(shí)間。本研究對三氧預(yù)充回收自體血后紅細(xì)胞流變學(xué)和功能的變化進(jìn)行探索，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年2月至2020年10月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬嘉興市中醫(yī)醫(yī)院收治的擬行全身麻醉下手術(shù)、術(shù)中需自體血回收的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）美國麻醉師協(xié)會（ASA）麻醉危險(xiǎn)度分級I～I(xiàn)I 級[6]；（2）術(shù)前6 個(gè)月內(nèi)無異體血輸注史；（3）經(jīng)詳細(xì)介紹研究內(nèi)容后，了解研究內(nèi)容并自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)或慢性失血性疾病；（2）合并高脂血癥、低血鈣、低血糖及低血壓；（3）合并血小板減少、凝血功能障礙；（4）合并中重度貧血及肝腎功能異常。共納入符合條件的患者45例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方案 所有患者入室后即行常規(guī)心率、心電、血壓及血氧飽和度監(jiān)測，完成外周靜脈置管。行靜吸復(fù)合氣管插管內(nèi)全身麻醉，于右側(cè)鎖骨下或頸內(nèi)靜脈穿刺置管，穿刺橈動脈，持續(xù)監(jiān)測動脈壓，同時(shí)監(jiān)測呼氣末二氧化碳分壓及吸入麻醉藥物濃度。術(shù)中芬太尼、丙泊酚、七氟烷與順式阿曲庫銨維持麻醉。患者手術(shù)及麻醉均由同組醫(yī)師完成。

1.2.2 自體血回收 采用京精自體血液回收機(jī)（3000P 型）實(shí)施術(shù)中血液回收，包括抗凝、收集、過濾、分離及洗滌[7]。（1）抗凝：將2500U肝素加入500ml0.9%氯化鈉注射液中，以50ml肝素抗凝劑填充回收管道及回收罐內(nèi)過濾膜，以避免回收血直接接觸管壁和過濾膜所致凝血，然后選擇適當(dāng)?shù)乃俣然旌匣厥昭海苊庋耗邸＃?）收集：切皮后開始血液回收，回收血液包括術(shù)中出血、體內(nèi)出血，將回收血和抗凝劑比例調(diào)整為50∶1。（3）過濾：選擇孔徑40 m的過濾膜，將回收期間的異物濾出，過濾后的自體血存放于專用儲血罐中。（4）分離：將離心分離泵轉(zhuǎn)速設(shè)定為5600r/min，離心分離回收自體血，當(dāng)血細(xì)胞出現(xiàn)血層時(shí)，設(shè)備自動暫停血液進(jìn)入。（5）洗滌：使用0.9%氯化鈉注射液對回收的血細(xì)胞進(jìn)行清洗，清洗轉(zhuǎn)速400 r/min，用2 000 ml 洗滌液洗滌回收的血1 單位，以洗去受損的血細(xì)胞等。（6）儲存：將洗滌完畢的紅細(xì)胞懸液排放到血液儲存袋中儲存。

1.2.3 三氧處理 從儲血袋內(nèi)抽出30ml紅細(xì)胞懸液注入專用的抗氧化的三氧自體血血袋，將現(xiàn)場制備的25 g/ml的30ml三氧氣體注入三氧血袋[8]，并按同一方向緩慢的圓周運(yùn)動將自體血與三氧混合轉(zhuǎn)動約5 min。立即抽出5 ml自體血（T1），30 min 再抽出5 ml 自體血（T2），60 min抽出5 ml 自體血（T3），90 min 抽出5 ml自體血（T4），120 min 抽出5 ml 自體血（T5），150 min 抽出5 ml 自體血（T6）。同時(shí)采集儲血袋三氧未處理的5 ml 自體血（T0）。血液離心分離前從儲血罐采集5 ml 原始血液。

1.3 觀察指標(biāo) 所有采集血液立即以肝素鈉（10 IU/ml）抗凝，置于EP 管送化驗(yàn)室檢測分析。全部血樣測定紅細(xì)胞流變學(xué)參數(shù)、ATP 及2,3-DPG。其中紅細(xì)胞流變學(xué)參數(shù)包括紅細(xì)胞最大變形指數(shù)（DImax）、紅細(xì)胞綜合變形指數(shù)（IDI）、紅細(xì)胞取向指數(shù)（DIor）及紅細(xì)胞小變形指數(shù)（DId）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)。＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞流變學(xué)參數(shù)變化 三氧處理血T3、T4、T5、T6 時(shí)點(diǎn)DImax、DId 均較T1 時(shí)點(diǎn)下降（均＜0.05），T4、T5、T6 時(shí)點(diǎn)DIor 均較T1 時(shí)點(diǎn)下降（均＜0.05）；原始血液T2、T3、T4、T5、T6 時(shí)點(diǎn)DImax、IDI、DIor、DId 均較T1 時(shí)點(diǎn)下降（均＜0.05）；三氧處理血T2、T3、T4、T5、T6時(shí)點(diǎn)DImax、IDI、DIor、DId 均高于原始血液同時(shí)點(diǎn)水平（均＜0.05）。見表1～4。

表1 DImax 變化比較

2.2 紅細(xì)胞功能參數(shù)變化 三氧處理血T3、T4、T5、T6 時(shí)點(diǎn)ATP、2,3-DPG 含量均較T1 下降（均＜0.05），原始血液T2、T3、T4、T5、T6 時(shí)點(diǎn)ATP、2,3-DPG含量均較T1 下降（均＜0.05）；三氧處理血T2、T3、T4、T5、T6 時(shí)點(diǎn)ATP、2,3-DPG 含量均高于原始血液同期水平（均＜0.05）。見表5～6。

表2 IDI 變化比較

表3 DIor 變化比較

表4 DId 變化比較

表5 ATP 變化比較 mol/gHb

表6 2,3-DPG 變化比較 g/L

3 討論

紅細(xì)胞的功能是攜帶和供給氧氣，也是人體內(nèi)重要的血細(xì)胞。紅細(xì)胞的變形能力是決定體內(nèi)紅細(xì)胞功能和存活時(shí)間的重要因素[9]。輸血后，如果紅細(xì)胞質(zhì)量和功能下降，輸血后臨床效果不佳，甚至導(dǎo)致輸血不良反應(yīng)[10]。由于自體血與管道的接觸、吸引器的吸引、沖洗及離心等機(jī)械作用，紅細(xì)胞的破壞不可避免。大量研究表明，表面清洗后回收的紅細(xì)胞變形能力明顯下降[11-12]，這可能主要是由于不同直徑的人工血管內(nèi)紅細(xì)胞出現(xiàn)異常漩渦、泵擠及離心分離等，對紅細(xì)胞形成剪切力，導(dǎo)致變形減小和黏附力增強(qiáng)。在恢復(fù)過程中，血液不斷稀釋，膠體滲透壓下降，使水分不斷轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，引起細(xì)胞腫脹，細(xì)胞表面積體積比下降，雙凹盤狀消失，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形能力下降，甚至溶血。在血液回收過程中，通過不同途徑產(chǎn)生大量的氧自由基，造成脂質(zhì)過氧化損傷。紅細(xì)胞膜脂不飽和脂肪酸對氧自由基氧化極為敏感，容易產(chǎn)生細(xì)胞毒性脂質(zhì)過氧化物，膜蛋白和血紅蛋白受損，紅細(xì)胞流變學(xué)降低，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形能力下降。此外，術(shù)中回收的血液經(jīng)離心清洗后得到的紅細(xì)胞懸液暫時(shí)儲存在輸血袋內(nèi)，麻醉醫(yī)師根據(jù)術(shù)中具體情況適時(shí)回輸，因此回收的紅細(xì)胞懸液有時(shí)可能需要在室溫下保存一段時(shí)間，甚至長達(dá)3～4h，如何讓回收的紅細(xì)胞懸液在體外較長時(shí)間保持穩(wěn)定的雙凹圓盤形結(jié)構(gòu)，關(guān)系到回收的紅細(xì)胞回輸后的效果及安全性[13]。

本研究結(jié)果顯示未經(jīng)處理的原始血液回收后，其DImax、IDI、DIor 及DId均持續(xù)下降，意味著紅細(xì)胞變形性逐漸降低，攜氧能力持續(xù)減弱；同時(shí)，原始血液的ATP、2,3-DPG 亦隨時(shí)間呈下降趨勢，說明紅細(xì)胞活性下降，能量物質(zhì)減少，儲存損傷逐漸加劇。三氧在治療高血脂、心腦血管疾病、周圍神經(jīng)疾病、腰椎間盤突出、皮膚疾病和疼痛等疾病方面已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成果，這與三氧的以下機(jī)制有關(guān)[14]：（1）三氧能與血液、組織液、淋巴及尿液等體液接觸，產(chǎn)生兩種強(qiáng)氧化劑，即單氧原子（O）和過氧化氫（H2O2）。單個(gè)氧原子的活性極強(qiáng)，不僅能夠?qū)е?,3-DPG 含量上升，還可造成紅細(xì)胞對氧的親和力下降，此時(shí)紅細(xì)胞的攜氧能力上升，從而更容易向需氧組織釋放氧；（2）三氧可激活2,3-DPG進(jìn)血紅蛋白釋放氧，提高患者血中的ATP 含量；（3）三氧可使作為自由基清除劑的酶產(chǎn)生增加及活力增高；（4）三氧能直接改善紅細(xì)胞膜表面電離子排序，可以使細(xì)胞膜表面負(fù)電荷增加，紅細(xì)胞的沉降率也隨之降低，從而減低或清除紅細(xì)胞的凝聚，改善紅細(xì)胞的柔順度和伸展性，提高血液攜氧能力。

本研究結(jié)果示在獲得自體血并經(jīng)三氧處理后的30～60 min 內(nèi)，三氧處理血的DImax、IDI、DIor、DId、ATP 及2,3-DPG均未見明顯變化，且在血樣取出后的各個(gè)時(shí)點(diǎn)，其紅細(xì)胞流變學(xué)、功能均優(yōu)于原始血液，顯現(xiàn)出三氧預(yù)充回收自體血在短時(shí)間內(nèi)保護(hù)紅細(xì)胞變形性、活性、能量及攜氧能力方面的積極作用。三氧自體血回輸技術(shù)是采用外周靜脈采集的自體血為原料，在體外通過與精確的三氧氣體反應(yīng)，再在短時(shí)間內(nèi)（約15min）回輸體內(nèi)，可以認(rèn)為，在此時(shí)間段內(nèi)，三氧處理血能夠保證紅細(xì)胞儲存質(zhì)量，減少紅細(xì)胞儲存損傷，保證紅細(xì)胞回輸?shù)男Чc安全性。