銅離子對中華絨螯蟹幼蟹的急性致死效應及組織顯微結構的影響

童帥旗，付龍龍，蔣琦辰，苗珍，張曉君*，潘建林

（1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州225009；2.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京210017）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），俗稱河蟹、大閘蟹等，屬于節肢動物門，甲殼綱，十足目，方蟹科，絨螯蟹屬[1]。中華絨螯蟹的養殖在我國水產業中有著十分重要的地位，每年為養殖戶創造了可觀的收益[2]。然而由于部分養殖戶用藥的不規范，導致環境問題日益突出，向環境中排放的污染物也逐年增多[3]。

銅是機體生長發育過程中所必需的微量元素，是甲殼類合成血藍蛋白所必需的營養元素之一，在細胞活動中也扮演著重要的角色[4]，但是高濃度的銅會對機體產生毒性效應[5]，并且由于銅參與機體的生命活動，更易被吸收，導致在體內大量積累[6]。由于銅離子（Cu2+）具有良好的滅藻及殺滅部分寄生蟲的效果，廣泛用于水體消毒[7]。銅是我國養殖水域中超標最嚴重的重金屬之一[8]。因此，現以中華絨螯蟹幼蟹為研究對象，研究了Cu2+對其急性致死效應，以及不同濃度Cu2+對其組織顯微結構的影響，為進一步評價Cu2+在水產養殖中的危害提供了理論基礎。

1 材料方法

1.1 試驗材料

試驗用中華絨螯蟹取自江蘇省淡水水產研究所浦口基地，挑選附肢完好、體表無損傷、活力強、大小均勻且平均體質量為（29.24±4.42）g的中華絨螯蟹為試驗對象。中華絨螯蟹從養殖池塘取回后，于玻璃水族箱（80 cm×50 cm×50 cm）中馴化兩周，水溫為21℃，溶解氧質量濃度為5 mg/L，光暗比為12 h∶12 h，每天早晚投喂中華絨螯蟹專用飼料。試驗前1 d將中華絨螯蟹移入試驗用塑料箱（60 cm×40 cm×25 cm）中，并停止投喂。試驗用Cu2+是由五水硫酸銅（CuSO4·5H2O2）分析純溶解而成，用19.53 g CuSO4·5H2O2溶解于1 L純水中，制備為5 g/L的Cu2+母液。試驗用水均為提前曝氣24 h以上的自來水。

1.2 Cu2+對中華絨螯蟹幼蟹LC50的測定

文獻［9-11］中Cu2+對中華絨螯蟹的半致死濃度設計預試驗，根據預試驗得出的最大全存活濃度和最低全致死濃度設計半致死濃度測定試驗。設Cu2+質量濃度為0.5，1.0，2.0和4.0 mg/L的4個試驗組進行半致死濃度測定[12]，試驗前一天停止投喂，每天各試驗組全部換水，并及時補充Cu2+。

1.3 Cu2+脅迫后肝胰腺及鰓組織病理變化

急性毒性試驗組共四組，其Cu2+質量濃度分別為0，0.1，0.2和0.4 mg/L，每組3個平行，每個平行10只中華絨螯蟹，試驗前一天停止投喂，每天各組全部換水。于24，48和96 h各試驗組取6只中華絨螯蟹在冰上處死，取其肝胰腺和鰓組織并用Bouin’s液固定。然后送樣至武漢塞維爾生物科技有限公司，進行石蠟包埋切片。

2 結果

2.1 半致死濃度

根據中華絨螯蟹幼蟹各時間段的死亡率計算半致死濃度[13]。死亡率及96 h LC50見表1、表2和表3。

表1 Cu2+對中華絨螯蟹幼蟹24～96 h死亡率%

表2 Cu2+對中華絨螯蟹幼蟹24～96 h LC50

表3 96 h LC50置信區間（a對數底=10）

2.2 Cu2+脅迫后肝胰腺組織切片觀察

研究顯示，隨著ρ（Cu2+）的升高，中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺組織的病理變化越明顯，見圖1（a）（b）（c）（d）。ρ（Cu2+）=0.1 mg/L處理組表現為肝小管變窄，細胞中出現空泡；ρ（Cu2+）=0.2 mg/L處理組表現為基膜變薄，肝小管變粗，細胞中空泡進一步增多增大；ρ（Cu2+）=0.4 mg/L處理組表現為基膜與肝小管單層柱狀上皮直接形成空腔，單層柱狀細胞不規則腫大，細胞中普遍出現大量空泡，肝小管中甚至出現細胞碎片。

2.3 Cu2+脅迫后鰓組織切片觀察

研究顯示，隨著ρ（Cu2+）的升高，中華絨螯蟹幼蟹鰓組織的病理變化就越明顯，見圖2（a）（b）（c）（d）。ρ（Cu2+）=0.1 mg/L處理組表現為鰓葉不規則增厚，鰓絲血腔增大；ρ（Cu2+）=0.2 mg/L處理組表現為鰓葉不規則增厚，上皮層損傷，角質膜隆起，細胞核聚集增多；ρ（Cu2+）=0.4 mg/L處理組表現為鰓葉不規則增厚，上皮層嚴重損傷，甚至解體。

圖1不同Cu2+濃度脅迫下中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺變化

圖2不同Cu2+濃度脅迫下中華絨螯蟹幼蟹鰓變化

3 討論

陳細香等[14]研究指出，Cu2+對于克氏原螯蝦的96 h LC50為5.28 mg/L，比該研究中得出的中華絨螯蟹幼蟹96 h LC50高出許多，表明克氏原螯蝦對于重金屬銅的耐受能力更強。黃鶴忠等[15]研究指出Cu2+對于中華絨螯蟹大眼幼體的96 h LC50為1.50 mg/L，與本研究結果相近，說明中華絨螯蟹大眼幼體與幼蟹對于重金屬銅有著相近的耐受力。趙云龍等[16]研究指出，Cu2+對于花鰍的96 h LC50為0.298 mg/L，遠低于本研究中的中華絨螯蟹幼蟹96 h LC50，說明花鰍對于重金屬銅的耐受性相對較低，Cu2+污染可能對其會造成更為嚴重的危害。Oliva等[17]研究指出，Cu2+對于云斑厚紋蟹的96 h LC50為0.50 mg/L，遠低于本研究中中華絨螯蟹幼蟹96 h LC50，說明中華絨螯蟹幼蟹的重金屬銅耐受性較強。Yang等[11]研究指出Cu2+脅迫中華絨螯蟹會使其腎小管壁增厚、上皮細胞變性分離、基底膜與單層柱狀上皮之間形成大空泡、小管腔內可見大量碎片，與本研究結果相似。Na等[18]研究發現，羅氏沼蝦暴露在0.01～0.40 mg/L Cu2+中，會導致其鰓小片腫脹融合、鰓尖異常、鰓內小片增生壞死，肝胰腺可見血細胞增多、基底板增厚、肝小管壞死，與本研究結果相似，說明Cu2+對甲殼類鰓和肝胰腺危害嚴重。王濤等[19]的研究指出，暗紋東方鲀暴露在0.1和0.2 mg/L（96 h LC50）Cu2+濃度中，會導致其肝臟血細胞沉積以及血竇擴張、鰓上皮細胞增生產生動脈瘤，說明Cu2+對于暗紋東方鲀的毒性要高于中華絨螯蟹幼蟹。

銅雖然是甲殼類生長發育所必需的微量元素，但過量的攝入還是會對其造成嚴重的病理損傷。該研究發現其對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺及鰓組織的損傷十分嚴重，可造成形態變化及功能障礙，對中華絨螯蟹幼蟹正常生長發育有著嚴重的危害。