溶解氧對克氏原螯蝦肝胰腺ATPase活性的影響

黃樺，陳敏怡，李佳佳，朱曉榮，顧偉

（1.常州市武進(jìn)區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 常州213017；2.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京210046；3.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京210017）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱淡水小龍蝦，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼綱，十足目，螯蝦科，原螯蝦屬。原產(chǎn)于美洲，在20世紀(jì)早期經(jīng)日本引入我國，隨后迅速在各地繁衍，現(xiàn)已成為我國重要的經(jīng)濟(jì)淡水養(yǎng)殖蝦類[1-2]。溶解氧是影響水生生物生長和發(fā)育的重要環(huán)境因子，特別是在蝦類養(yǎng)殖過程中，水體中溶解氧應(yīng)控制在5 mg/L以上，否則對蝦類的生長不利[3]。肝胰腺中消化酶活力的變化與溶解氧水平具有顯著相關(guān)性，對于甲殼動(dòng)物而言，消化酶活性在營養(yǎng)生理方面起著重要的作用，直接影響著甲殼動(dòng)物的生長、蛻殼和攝食[4]。因此通過觀察克氏原螯蝦肝胰腺可以對其健康程度進(jìn)行判斷[5]。目前關(guān)于溶解氧對克氏原螯蝦肝胰腺ATPase活性影響的報(bào)道較少。該試驗(yàn)通過模擬不同養(yǎng)殖環(huán)境下溶解氧對克氏原螯蝦死亡率的影響，對不同規(guī)格和不同性別的克氏原螯蝦在高溶氧和低溶氧環(huán)境下肝胰腺ATPase活性變化規(guī)律進(jìn)行研究，旨在為完善和優(yōu)化克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料：試驗(yàn)用克氏原螯蝦于2020年8月取自江蘇省常熟市尚湖，選擇附肢齊全且健康無病的個(gè)體待用?？耸显r規(guī)格分為大蝦（40±2）g，中蝦（30±2）g和小蝦（20±2）g。

試劑：0.86%生理鹽水，ATPase測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 研究方法

（1）預(yù)處理。在試驗(yàn)前先將克氏原螯蝦馴養(yǎng)7 d，馴養(yǎng)期間不間斷充氣，每天定時(shí)喂食1次，換水30%，及時(shí)撈出死蝦和排泄物，自然死亡率低于5%。

（2）溶解氧對克氏原螯蝦成活率的影響試驗(yàn)。選取克氏原螯蝦的中蝦分為A、B兩組，每組20只，雌雄各半。每天18：00觀察一次，進(jìn)行喂食和換水，并記錄蝦的死亡數(shù)。A組增氧處理，溶解氧為（8.0±0.2）mg/L；B組封閉處理，溶解氧為（0.8±0.2）mg/L。

（3）溶解氧對不同規(guī)格和性別克氏原螯蝦ATPase活性的影響試驗(yàn)。設(shè)置2個(gè)溶解氧水平，分別為低溶解氧組（0.8 mg/L）和高溶解氧組（8.0 mg/L）。每組設(shè)置4個(gè)組別，分別為大蝦組（雌雄蝦各10只）、小蝦組（雌雄各10只）、雌蝦組（大小蝦各10只）、雄蝦組（大小蝦各10只）。

（4）酶液制備。當(dāng)?shù)腿芙庋踅M中的克氏原螯蝦出現(xiàn)昏厥時(shí)，各試驗(yàn)組均隨機(jī)取出1只活蝦，沖洗后擦干，迅速取出肝胰腺，用生理鹽水對其進(jìn)行清洗，濾紙吸干，用剪刀將肝胰腺一分為二，分別準(zhǔn)確稱重。按肝胰腺質(zhì)量（g）和生理鹽水（mL）1∶9的比例加入生理鹽水，用玻璃研磨皿研磨制備10%的組織勻漿，1 500 r/min離心10 min，取上清液稀釋成2%的勻漿待測。

（5）酶活性測定。Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase酶活性均采用鉬銨酸顯色測磷法，通過試劑盒進(jìn)行測定。酶促反應(yīng)定磷，混勻，室溫靜置5 min，于分光光度計(jì)中636 nm處測定各處理組吸光度值（OD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每小時(shí)每毫克蛋白的組織中ATPase分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)ATPase活性單位，即μmol/（mg·h）。組織中ATPase活性（U/mg）=（測定管OD值-對照管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（0.02 mmol/L）×6×7.8÷（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）÷勻漿蛋白含量（g/L）。所有結(jié)果數(shù)據(jù)均為3個(gè)樣品的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解氧對克氏原螯蝦成活率的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，增氧處理下A組死亡率較低，僅為20%，而B組在低氧條件下全部死亡（表1）。

表1不同溶解氧水平下克氏原螯蝦的死亡率

2.2 溶解氧對克氏原螯蝦肝胰腺ATPase活性的影響

ATPase酶活性測定結(jié)果顯示，大蝦Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性均低于小蝦；雄蝦Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性較雌蝦均處于較高水平。高溶解氧組中大蝦的Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性高于低溶氧組，而其他三組處理中，高溶解氧組蝦體的Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性比低溶解氧組低（表2和表3）。

表2不同溶解氧含量下克氏原螯蝦肝胰腺中Na+/K+-ATPase的活力值

表3不同溶解氧含量下克氏原螯蝦肝胰腺中Ca2+/Mg2+-ATPase的活力值

3 討論

3.1 溶解氧對克氏原螯蝦成活率的影響

水體中低溶解氧環(huán)境會(huì)引起甲殼類攝食量的減少，導(dǎo)致甲殼類生長緩慢，甚至死亡[6]。試驗(yàn)中，高溶解氧處理的A組克氏原螯蝦死亡率較低，而低溶解氧處理的B組蝦全部死亡，這與上述結(jié)論一致。因此，在克氏原螯蝦生產(chǎn)中，在必要情況下對養(yǎng)殖水體進(jìn)行增氧操作處理，可以有效減少克氏原螯蝦的死亡率。

3.2 溶解氧對克氏原螯蝦肝胰腺中ATPase活性的影響

現(xiàn)有研究表明，克氏原螯蝦在處于低溶解氧狀態(tài)下，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷并影響體內(nèi)離子平衡。蝦體可通過自我調(diào)節(jié)，主要是增加Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性來維持體內(nèi)的離子平衡[7]。生物體在不良環(huán)境下Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase的應(yīng)激反應(yīng)同樣也在其他物種中得以證實(shí)[9-13]。試驗(yàn)中，小蝦、雄蝦與雌蝦三組中高溶解氧組蝦體的Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性低于低溶解氧組，這與上述結(jié)論一致，在大蝦組則相反，大蝦的生長需要氧和酶的參與，試驗(yàn)中大蝦高溶解氧組蝦體的Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性高于低溶氧組。

試驗(yàn)中，大蝦Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性均低于小蝦，溫小波等[14]研究發(fā)現(xiàn)隨著蝦體質(zhì)量的增加，蛋白質(zhì)和碳水化合物提供的能量占比增大，而脂肪提供的能量逐步減小，這使得肝胰腺中酶活性下降。而同齡親蝦中，雌蝦較雄蝦個(gè)體大，因此試驗(yàn)中雄蝦Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性比雌蝦高，與上述觀點(diǎn)相符。因此，養(yǎng)殖水體溶解氧狀態(tài)會(huì)影響克氏原螯蝦肝胰腺Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性，且與其體質(zhì)量和性別相關(guān)。