不同水平綠原酸對肉兔生長性能、抗氧化性能和肝臟微觀結構的影響

劉靜慧，李沖，徐美利，牛志平，侯玉春，劉亞娟，陳寶江*

(1. 河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071000；2. 中國農業科學院飼料研究所，北京 100081；3. 晨光生物科技集團股份有限公司，河北 邯鄲 056000；4. 廊坊市永清縣農業農村局，河北 廊坊 065600；5. 河北農業大學山區研究所，河北 保定 071000；6. 河北省山區農業工程技術研究中心，河北 保定 071000)

隨著我國飼料全面禁抗，抗生素替代品的需求進一步增加，其中植物提取物是抗生素替代品研究開發中的熱點。綠原酸(chlorogenic acid,CGA)是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，是植物有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生一種苯丙素類化合物，其廣泛存在于多種植物中，以金銀花、杜仲中含量較高。綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝利膽、抗腫瘤等多種生物活性[1]，在動物生產中有一定的應用。伏桂華等[2]在黃河鯉魚飼糧中添加0.045%綠原酸，日增重顯著提高，肌肉中粗蛋白含量提高、粗脂肪含量降低，肌肉品質有所改善。王宇等[3]在仔豬日糧中添加1 000 mg/kg綠原酸，料重比顯著降低，仔豬血清IgG含量顯著提高，免疫功能增強，小腸黏膜結構形態得到改善。但綠原酸在兔生產中的研究報道較少，限制了其在兔生產中的應用。因此本試驗通過飼喂含不同水平綠原酸的飼糧，研究其對伊拉肉兔生長性能、血清抗氧化性能以及肝臟抗氧化性能和肝臟微觀結構及的影響，為其在兔生產中的進一步研究和應用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和分組

選擇35日齡斷奶伊拉兔60只(由河北農業大學畜牧教學基地提供，生長試驗全程在河北農業大學畜牧教學基地完成)，體重相近，公母各半，采用單因素完全隨機設計，分為5組，每組12只。其中：對照組飼喂基礎飼糧；抗生素組在基礎飼糧中添加18.80 mg/kg桿菌肽鋅和15.51 mg/kg喹烯酮；綠原酸組按添加劑量分成3組，即：CGA500組、CGA1000組和CGA2000組，在基礎飼糧中分別添加500、1 000和2 000 mg/kg綠原酸。

1.2 飼糧設計

綠原酸(有效含量≥80%)由晨光生物科技集團股份有限公司提供。基礎飼糧參照谷子林[4]推薦的兔營養需要進行配制，飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

2)消化能為計算值，其他營養水平為實測值

1.3 飼養試驗

試驗前對兔舍和籠具進行清理和消毒，采用育成兔三層階梯式金屬籠單獨飼養，對每只兔籠進行單獨編號，自然通風和光照，試驗期間平均溫度23 ℃，平均濕度55%，自由采食和飲水，每天8：00和18：00飼喂2次，投料后2 h對兔舍進行糞便清理、衛生清掃。預試期7 d，正試期28 d。預試期后空腹稱重，記錄初始體重，確定各組重量無顯著性差異后進入正試期。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 生長性能

正式試驗開始和第28天，分別稱量各組試驗兔的體重獲得初始重和末重，計算平均日增重(ADG)，統計試驗期間試驗兔的采食量，計算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。統計試驗期間試驗兔的腹瀉情況，計算獲得腹瀉頻率，公式：腹瀉頻率=試驗期內腹瀉只日數/(試驗天數×試驗只數)×100%。

1.4.2 肝臟指數

試驗結束后，每組挑選體重接近該組平均值試驗兔6只，屠宰前稱量宰前活重，屠宰后取肝臟，用眼科剪剔除脂肪和結締組織后稱量器官重，計算肝臟指數，公式：肝臟指數(g/kg)=肝臟重量(g)/宰前活重(kg)。

1.4.3 血清抗氧化指標

試期結束后，試驗兔空腹12 h，每只采血3 mL，采血管呈45°斜面靜置，待血清析出后4 000 r/min離心10 min，分裝上清，于-80 ℃保存待測。采用生化法測定超氧化物歧化酶( SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)的活性和水平，試劑盒購自北京百智生物科技有限公司，貨號分別為BCEA002、BCBU-011、BCOS-009，具體操作按試劑盒說明書指示進行。

1.4.4 肝臟抗氧化性能

取試驗兔肝臟，研磨后按1∶9比例與PBS緩沖液混勻，4 000 r/min離心10 min，分裝上清，于-80 ℃保存待測，采用生化法測定 SOD、T-AOC和MDA的活性和水平，具體操作按試劑盒說明書指示進行。

1.4.5 肝臟微觀結構

取各組試驗兔肝臟左葉相同位置固定于10%福爾馬林，HE染色制作石蠟切片，在光鏡下觀察各試驗兔肝臟微觀結構變化。

1.5 統計分析

試驗數據采用 SPSS 21.0統計軟件進行單因素方差分析，Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05為差異顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 綠原酸對肉兔生長性能的影響

由表2可知，對照組和抗生素組間各指標差異不顯著。與對照組及抗生素組相比，CGA2000組肉兔的末重分別顯著提高了9.90%和9.82%(P<0.05)。與對照組相比，CGA2000組肉兔的平均日增重也顯著提高了18.73%(P<0.05)。腹瀉率方面，以對照組最高，綠原酸組隨著添加劑量的增加有降低的趨勢，抗生素組最低。

表2 綠原酸對肉兔生長性能的影響

2.2 綠原酸對肉兔肝臟指數的影響

由表3可知，各組的肝臟指數無顯著差異(P>0.05)，但CGA2000組與對照組相比有上升趨勢(0.05

表3 綠原酸對肉兔肝臟指數的影響 g/kg

2.3 綠原酸對肉兔血清抗氧化性能的影響

由表4可知，與對照組相比，抗生素組T-AOC的活性提高了20.00%，差異顯著(P<0.05)，綠原酸組血清T-AOC、SOD活性及MDA水平均無顯著差異(P>0.05)，但CGA2000組T-AOC和SOD活性較對照組均有上升的趨勢(0.05

表4 綠原酸對肉兔血清抗氧化指標的影響

2.4 綠原酸對肉兔肝臟抗氧化性能的影響

由表5可知，對照組和抗生素組各指標差異不顯著，CGA1000組T-AOC活性較抗生素組顯著提高了20.00%(P<0.05)，其他各組內無顯著性差異(P>0.05)。添加1 000～2 000 mg/kg綠原酸與對照組相比SOD和T-AOC活性均有增高趨勢，MDA水平有下降趨勢(0.05

表5 綠原酸對肉兔肝臟抗氧化指標的影響

2.5 綠原酸對肉兔肝臟微觀結構的影響

由圖2可知，對照組肝細胞形態基本正常，但有少許局部輕微纖維增生與輕微點狀壞死，綠原酸組與抗生素組肝臟組織被膜完整，肝小葉分葉不明顯，中央靜脈內皮完整，肝索排列較規則；肝細胞形態基本正常，未見明顯病理變化。

A.對照組；B.抗生素組；C.CGA500組；D.CGA1000組；E.CGA2000組

3 討論

3.1 綠原酸對肉兔生長性能的影響

飼糧中添加CGA可以改善動物的生長性能。劉則學等[5]報道，在仔豬飼糧中添加250 g/t 的CGA，可以使仔豬的料重比顯著降低，腹瀉頻率有降低的趨勢，改善了仔豬的生長性能。Chen等[6]在斷奶仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg的CGA后發現，仔豬的飼料轉化率顯著提高。陳鵬等[7]在斷奶仔豬飼糧中添加CGA后發現，仔豬的平均日增重顯著提高，生長性能得到改善。本試驗中，與對照組和抗生素組相比，GCA2000組肉兔的末重顯著升高，與上述報道的結果相近。分析可能的原因是通過添加CGA改善了機體抗氧化能力，從而提高了肉兔的生長性能；同時CGA還具有抗菌、消炎以及增強免疫力等作用，對肉兔具有益生作用[8]。

3.2 綠原酸對肉兔肝臟指數的影響

本試驗表明添加綠原酸有改善肝臟指數的趨勢。袁俊[9]給高血糖小鼠灌服2 500 μg/g CGA后發現，臟器損傷好轉，肝臟腫大恢復正常，表明CGA對小鼠的肝臟有一定的保護作用。其可能的原因是CGA具有抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫調節等多種生物學功能，減少了各種應激及細菌、病毒對肉兔免疫系統的影響，間接有益于肝臟的發育[10]。

3.3 綠原酸對肉兔血清抗氧化性能的影響

本試驗結果表明，與對照組相比，CGA2000組肉兔血清T-AOC和SOD活性雖無顯著差異但均有升高的趨勢，說明CGA一定程度上增強了肉兔的抗氧化性能。劉英等[11]報道，添加300 mg/kg CGA可以使斷奶仔豬血漿中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)的活性顯著升高，增加了仔豬的抗氧化性能。符運斌[12]在肉牛飼料中添加CGA后發現，肉牛血清中GSH-Px、SOD和 T-AOC的活性均顯著升高，MDA含量降低，減少了熱應激下肉牛的脂質過氧化損失。黃少文等[13]在母豬飼糧中添加300 mg/kg CGA后發現，母豬血清中GSH-Px和CAT分別提高了24.00%和38.56%。上述報道與本試驗結果相近，但CGA對肉兔抗氧化性能的改善效果不如仔豬、母豬以及肉牛，這可能和畜種及試驗處理的差異有關。CGA是一種酚型抗氧化劑，一方面其酚羥基結構能與自由基反應，使其失活，減少對機體的氧化應激；另一方面，其可以通過Keep1-Nrf2-ARE信號通路，上調其下游SOD1、CAT、GPX1、GST、GR等基因的表達，促進抗氧化酶的合成，增強機體的抗氧化能力[14]。

3.4 綠原酸對肉兔肝臟抗氧化性能的影響

肝臟是機體代謝的重要器官，本試驗中，添加1 000～2 000 mg/kg CGA與對照組相比，肝臟抗氧化性有提高趨勢，添加1 000 mg/kg CGA比抗生素組顯著提高了T-AOC水平，對機體肝臟抗氧化能力有所改善。栗靈皓等[15]給高糖高脂大鼠飼喂綠原酸，高劑量組可顯著提高肝臟SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活力，降低MDA水平，有效預防和減輕肝臟氧化損傷。Koriem等[16]研究證實CGA同分異構體5-二咖啡酰奎寧酸(5-CQA)能減輕脫氧麻黃堿導致的大鼠氧化應激反應，提高肝臟中SOD和GSH-Px水平，降低MDA含量。上述報道與本試驗的結果相近，原因可能是綠原酸可通過降低血脂和肝臟脂質的積累，提高血清和肝臟清除自由基能力和抗氧化水平[17]；也可能是綠原酸通過增加肝臟脂肪酸的作用，降低膽固醇，抑制炎癥反應，從而增加機體抗氧化能力[18-19]。

3.5 綠原酸對肉兔肝臟微觀結構的影響

本試驗中，對照組肉兔肝臟有少許局部輕微纖維增生與輕微點狀壞死，而CGA組肝細胞形態基本正常，未見明顯病理變化，說明CGA對肉兔的肝臟有一定的保護作用。Feng等[20]報道CGA可以通過增強小鼠的抗氧化能力和抑制炎癥反應，來緩解D-半乳糖引起的小鼠肝損傷。周艷等[10]報道添加CGA可以緩解大鼠由慢性內毒素引起的肝損傷。史秀玲等[21]報道添加3.5～14 mg/kg的CGA可以緩解由CCl4引起的小鼠肝損傷。楊宏昕等[22]也發現，添加100 mg/kg的CGA可以抑制由CCl4引起小鼠肝損傷。上述報道與本試驗的結果相近，其可能的原因是CGA可增強機體清除活性氧的能力和抗氧化能力，減少肝臟線粒體中的自由基，緩解肝臟脂質過氧化反應，從而發揮保肝作用[23]，此外CGA還能調節肝臟細胞葡萄糖的耐受性和胰島素敏感性從而改善肝臟的糖異生和脂質代謝[24]，以及能通過抑制透明質酸的活性增強肝臟的抗炎和抗感染能力[25]，減少肝臟的損傷。

綜上，添加綠原酸可以通過改善肉兔血清和肝臟的抗氧化能力來發揮保肝作用，改善肝臟形態結構，促進肝臟發育，從而提高肉兔生長性能，建議添加劑量為2 000 mg/kg。