豬源馬鏈球菌獸疫亞種分離鑒定

鄧汝森，張海龍，顏廣智，陳盛楠,2，顧萬軍,2，黃良宗,2*

(1. 佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2. 廣東方道基因科技有限公司，廣東 佛山 528000)

馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)屬于蘭氏分群的C群，是馬鏈球菌的一個亞種，具有宿主多樣性，可通過外傷、手術等途徑感染多種動物[1-3]，在中國主要流行于豬群和馬群[4]。引起馬腺疫的病原體除了馬鏈球菌馬亞種，還有馬鏈球菌獸疫亞種也是主要病原體之一[5]。馬鏈球菌獸疫亞種主要引起豬的腦膜炎、關節炎、肺炎、敗血癥以及突然死亡等[6]。該菌也可以感染人，是一種重要的人畜共患病病原體[7]。

類M蛋白(SzP)是馬鏈球菌獸疫亞種的重要毒力因子和主要的保護性抗原[8]，具有多種生物學功能。SzP作為該菌菌體表面一種生物大分子，與其他表面大分子一樣經受各種選擇性壓力作用，在進化過程中，會以一定的頻率發生變異，特別是因免疫選擇性壓力，其表面保護性抗原位點會因點突變而發生改變[9]。因此，SzP基因的變化能代表馬鏈球菌獸疫亞種的進化規律和趨勢。

2018年7月中旬，廣東省江門市某規模化豬場保育仔豬突然發生散發性急性死亡，豬場共有保育豬650頭，發病76頭，死亡17頭，發病率11.69%，死亡率2.62%。經調查，該豬場于2018年6月初注射豬鏈球菌2型滅活疫苗，發病后未用抗菌藥物進行治療。隨后立即剖檢病豬，經一系列細菌學檢測手段判定分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種，通過小鼠致病性試驗研究該分離菌對小鼠的致病力以及結合體外藥敏試驗篩選敏感藥物，以期為臨床防控馬鏈球菌獸疫亞種引發的疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料

豬腦組織樣品，采集于廣東省江門市某規模化養殖場臨床表現為神經癥狀的病豬。

1.2 主要試劑和實驗動物

PCR擴增試劑盒、DL2000 DNA Marker、Gold view 染料、氨芐青霉素、pMD18-T載體連接試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司；細菌DNA抽提試劑盒購自美基(Magen)生物公司；大腸埃希菌DH5α和馬鏈球菌獸疫亞種質控菌株ATCC 43079由佛山科學技術學院生命科學與工程學院預防獸醫學重點實驗室保存；藥敏紙片購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細菌微量生化鑒定管購自廣東環凱微生物科技有限公司；血清營養瓊脂平板(含10%小牛血清)、10%小牛血清肉湯、氨芐平板及LB液體培養基(氨芐濃度：100 mg/mL)和鮮血營養瓊脂平板均由佛山科學技術學院預防獸醫重點實驗室配制。48只5～7 周齡雄性BALB/c小鼠購于廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2019-0035。

1.3 細菌分離與鑒定

1.3.1 細菌分離鑒定與形態學觀察

無菌操作采取腦頂葉劃線接種于血清營養瓊脂平板(含0.01% NAD)，37 ℃培養24 h后觀察菌落生長情況及形態，挑取疑似單菌落在血瓊脂平板純化培養。挑取純培養的單菌落制作抹片，革蘭染色，觀察細菌形態特征。

1.3.2 細菌生化鑒定

按照單盒生化鑒定管使用說明書，對分離菌進行生化鑒定，并與伯杰細菌鑒定手冊(第8版)的生化結果進行比較。

1.3.3 細菌16S rRNA基因序列分析及SzP氨基酸序列分析

挑取純培養單菌落接種于10% 小牛血清肉湯，37 ℃、160 r/min恒溫震蕩培養24 h，按照細菌DNA抽提試劑盒說明書的操作過程抽提分離菌總DNA 用作PCR反應的模板。參考文獻[10]合成馬鏈球菌獸疫亞種SzP基因特異性引物，并用16S rRNA基因進行PCR擴增，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性產物做膠回收，并把回收產物連接到 pMD-18T 載體，連接產物轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞，旋轉混勻，置冰浴30 min，42 ℃水浴熱休克90 s后，迅速置冰浴5 min，加入1 mL LB培養液，37 ℃恒溫搖床培養45 min，4 500 r/min常溫離心5 min，吸取1 mL上清，將余液細胞均勻涂布于氨芐抗性的LB瓊脂培養基，37 ℃培養16 h。各挑取5個陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司進行測序。

表1 引物序列信息

1.4 小鼠毒力試驗

取培養至對數生長期的菌液，4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體。用生理鹽水重懸，調整原液，使100倍稀釋后的菌液OD600約為0.2，進行連續的10倍梯度稀釋并進行平板計數以確定實際接種量。同時選取4.87×104～4.87×108CFU細菌量接種5～7 周齡雄性BALB/c小鼠(腹腔注射0.1 mL/只)，每組8只，另設陰性對照組注射生理鹽水，連續觀察7 d，每天記錄小鼠的死亡情況，最后采用Karber法[11]計算半數致死量(LD50)。及時解剖死亡小鼠，觀察小鼠臟器變化，取腦組織和肺臟抹片，革蘭染色鏡檢；同時取臟器涂抹鮮血平板，置37 ℃培養24 h后進行細菌純化鑒定。

1.5 藥敏試驗

將純培養的細菌致密劃線接種于血清營養瓊脂平板表面。用無菌鑷子將氟苯尼考、替米考星、環丙沙星、大觀霉素、多西環素、慶大霉素、林可霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、頭孢曲松、阿莫西林、恩諾沙星、青霉素、阿米卡星、復方新諾明和復方阿莫西林16 種藥敏片均勻貼至培養基表面，倒置平板，37 ℃培養24 h，按美國臨床實驗室標準化委員會的藥敏試驗標準，根據抑菌圈直徑大小來判定結果。

2 結果

2.1 細菌形態觀察及生化鑒定

用無菌接種環將分離單菌落劃線接種于鮮血平板，37 ℃培養24 h，可見圓形、微隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明的菌落，呈現明顯的β溶血(圖1A)，革蘭染色鏡檢可見長短不一的鏈狀球菌(圖1B)，分離菌命名為SEZ20180618。通過細菌微量生化鑒定管檢測分離菌SEZ20180618的生化指標，結果馬尿酸鹽、山梨醇、海藻糖、甘油和七葉苷呈陽性，6.5%高鹽肉湯、菊糖、阿拉伯糖和甘露醇呈陰性，符合馬鏈球菌獸疫亞種生化特性。結合細菌形態和生化結果可初步判斷分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種。

2.2 細菌16S rRNA基因序列分析

采用16S rRNA通用引物對分離菌株SEZ20180618進行PCR擴增，產物經純化后連接pMD18-T載體測序。16S rRNA基因產物大小為1 466 bp(圖2)。將測序結果與GenBank中參考菌株16S rRNA基因序列進行同源性比對，發現分離菌株SEZ20180618的16S rRNA與馬鏈球菌獸疫亞種同源性>97%。采用MEGA7.0 軟件對分離菌株與參考菌株的16S rRNA基因序列構建系統進化樹，結果顯示，菌株SEZ20180618與馬鏈球菌獸疫亞種處于同一分支(圖3)。結合分離菌株SEZ20180618的形態觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA基因序列分析，最終判定分離菌株SEZ20180618為馬鏈球菌獸疫亞種。

A.血平板上生長；B. 革蘭染色鏡檢(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker；1. 陰性對照; 2. 16S rRNA基因; 3. 陰性對照; 4. SzP基因

注：▲為本試驗分離株

2.3 SzP氨基酸序列分析

對SzP基因進行PCR擴增，產物大小為364 bp(圖2)，利用MegAlign軟件中的Clustal W將測序結果與GenBank登錄的SzP基因序列進行同源性比較，發現分離菌株SEZ20180618與馬鏈球菌獸疫亞種參考菌株CT株(GU332844.1)、Cxy012株(AY263783.1)、SH00166株(AY263784.1)、HNC01株(EF421188.1)、47A株(KF214274.1)、FC04株(EF522946.1)、SEZ9407473D株(AF519472.1)和C3株(MH287001.1)的SzP氨基酸序列同源性達100%。

2.4 小鼠毒力試驗

小鼠腹腔按梯度注射SEZ20180618菌株死亡情況見表2。小鼠在攻毒12 h后出現精神沉郁、食欲降低、打堆等臨床癥狀，之后小鼠接連死亡。剖殺死亡小鼠，取脾臟、肝臟和腦等器官劃線分離細菌，均可分離出與馬鏈球菌獸疫亞種菌落形態、生長特性和生化特性相一致的細菌，并對分離菌用馬鏈球菌獸疫亞種SzP基因特異性引物PCR可擴增出與預期片段大小的條帶。根據表2計算SEZ20180618對小鼠的LD50為1.54×106CFU。

表2 SEZ20180618菌株對小鼠的LD50測定

2.5 藥敏試驗

分離菌SEZ20180618對復方阿莫西林、氟苯尼考、替米考星、環丙沙星、大觀霉素、多西環素、慶大霉素、林可霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、頭孢曲松、阿莫西林、恩諾沙星和青霉素共14 種抗生素均敏感；對阿米卡星、復方新諾明2種抗生素中度敏感(表3)。

表3 SEZ20180618藥敏試驗結果

3 討論

馬鏈球菌獸疫亞種是引起多種動物發病死亡的重要病原體，同時該菌經特定的途徑也可感染人，是一種重要的人畜共患病病原。本試驗對采自廣東省江門市某規模化豬場表現神經癥狀并死亡的保育豬的腦組織樣品進行細菌分離，獲得1株革蘭陽性鏈狀排列的球菌，該株分離菌在鮮血平板上呈現β溶血，結合細菌生化鑒定、16S rRNA及SzP基因克隆測序分析，確定該株分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種，命名SEZ20180618。

對分離純化培養的SEZ20180618進行小鼠毒力試驗，結果表明該菌株對BALB/c小鼠的LD50為1.54×106CFU，表明該株分離菌是具有較強毒力的馬鏈球菌獸疫亞種，由此推測馬鏈球菌獸疫亞種可能是該場保育豬發生神經癥狀死亡的重要原因之一。

體外藥敏試驗對臨床篩選敏感抗菌藥物治療疾病具有指導性作用[12]。藥敏試驗結果表明：分離菌SEZ20180618對復方阿莫西林、氟苯尼考、多西環素、阿莫西林、恩諾沙星、青霉素等14種抗菌藥物均敏感；對阿米卡星、復方新諾明2種抗菌藥物中度敏感。臨床應根據體外藥敏試驗結果選擇敏感抗菌藥物進行治療，同時應將發病豬隔離飼養，減少病原菌傳染，加強對豬舍環境的消毒工作，同時保持通風干燥的環境，減少病原菌滋生。

本研究通過實驗室診斷方法確診引起該豬場保育豬發生神經癥狀死亡的病原是馬鏈球菌獸疫亞種，為臨床診斷和治療提供可靠依據，同時對馬鏈球菌獸疫亞種感染的流行病學調查和候選疫苗菌株的選擇提供了實驗室參考依據。