注射用頭孢噻呋鈉在牛奶中的殘留消除研究

陳晨,董朕，張東輝，李冰，程富勝，張繼瑜，周緒正

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/農業農村部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

頭孢噻呋又名賽得福，是第一個專門用于動物的頭孢菌素類抗生素，由Upjohn公司研制并被用于獸醫領域，產品是鈉鹽形式的Naxcel?無菌粉[1]。頭孢噻呋的抗菌譜廣，可通過抑制細菌細胞壁的合成從而達到快速殺菌的作用[2-3]，廣泛用于畜禽養殖業[4]，但不規范使用會導致藥物殘留，引起細菌耐藥性增加，危害環境，而且通過食物鏈和環境直接或間接危害人類健康。歐盟制定頭孢噻呋在牛奶中的最大殘留限量(MRL)為100 μg/kg[5]；我國規定其在牛奶中的MRL為100 μg/kg，且規定其殘留標識物為去呋喃甲酰基頭孢噻呋(DFC)[6]。

頭孢噻呋進入動物體內后，絕大部分快速轉化為DFC等代謝物[7-9]，因為DFC在動物體內不穩定，動物體內的內源性物質會干擾DFC的直接檢測，所以通常檢測時先將不穩定的DFC轉化為穩定的乙酰胺去甲基頭孢噻呋(DCA)，可通過采用二硫赤蘚糖醇將DFC與蛋白質偶聯，進而通過碘乙酰胺處理生成穩定的DCA[10]。我國農業農村部1025號公告[11]頒布的用于動物性食品中頭孢噻呋殘留檢測的高效液相色譜法操作復雜、重復性差、靈敏度低。因此，本研究建立了高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)的方法用于檢測牛奶中頭孢噻呋殘留，以期更好地了解該藥物在牛奶中的殘留消除規律并制定休藥期。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

頭孢噻呋標準品：純度97.7%，購自Dr.Ehrenstirfer GmbH；乙腈、甲醇和甲酸：質譜純，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；二硫赤蘚醇：純度99%，購自國藥集團化學試劑有限公司；碘乙酰胺：純度98%，購自上海阿拉丁試劑有限公司；十四水合硼酸鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：購自國藥集團化學試劑有限公司；磷酸：購自天津市科密歐化學試劑有限公司；二甲基亞砜：色譜純，購自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 試驗動物

選取甘肅省某奶牛場的20頭荷斯坦奶牛(高產、低產奶牛各10頭)。所有牛在近1月內未使用頭孢噻呋類及與頭孢噻呋類結構相似的藥物。體型大小、精神狀態、膘情等均需符合健康狀態，體重在250～450 kg。

1.3 給藥和樣品采集

注射用頭孢噻呋鈉，粉針劑，規格為1.0 g，生產批號：DVK181001，由河北遠征藥業有限公司提供。按推薦劑量每千克體重2.2 mg肌肉注射給藥，連續3 d。于第1次給藥后4、12 h，第2次給藥后4、12 h，以及最后一次給藥后4、8、10、12和 24 h，采集4個乳區的混合奶樣，用于測定。

1.4 HPLC-MS/MS檢測牛奶中頭孢噻呋殘留

1.4.1 試劑的制備與保存

①取空白牛奶樣品作為空白試樣，添加適宜濃度的標準溶液作為空白添加試樣。②取儲備液(1 mg/mL)依次用超純水配置成50、100、200、400、600、1 000 μg/kg標準工作溶液。③0.05 mol/L硼酸緩沖液：稱取19 g十四水合硼酸鈉和3.7 g氯化鉀溶于900 mL水中，調節pH=9，用水定容至1 L。④0.025 mol/L磷酸緩沖液：將3.5 g磷酸二氫鈉溶于900 mL水中，調節pH=7.0，用水定容至1 L。⑤0.4% DTE提取液：稱取1.0 g二硫赤蘚醇，溶于250 mL 0.05 mol/L硼酸緩沖液中(現配現用)。⑥14%碘乙酰胺溶液：稱取7.0 g碘乙酰胺，溶于50 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液中(現配現用)。⑦25%磷酸溶液：取25 mL磷酸，加水溶解并稀釋至100 mL。⑧-20 ℃以下保存樣品。

1.4.2 樣品前處理方法

提取和衍生：取牛奶(1±0.01) g，加入標準溶液，渦動10 s，加0.4%二硫赤蘚糖醇溶液11 mL，渦動2 min，55 ℃水浴振蕩15 min，取出放置室溫，加14%碘乙酰胺溶液3 mL，避光室溫下靜置衍生30 min，用25%的磷酸緩沖調節pH值至2.3左右，4 500 r/min、4 ℃離心20 min，上清液轉移至另一支50 mL離心管中待用。

凈化：依次用10 mL甲醇、10 mL水活化C18萃取柱，取離心后的上清液過柱，用5 mL水淋洗之后，用6 mL 90%甲醇水溶液洗脫，洗脫液用氮吹儀吹干，用復溶液(0.1%甲酸水∶0.1%甲酸乙腈=80∶20)復溶殘余物，超聲10 min后，過0.22 μm濾膜，進行HPLC-MS/MS分析。

1.4.3 色譜條件

流動相：0.1%甲酸水，0.1%甲酸乙腈，流速：0.4 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。高效液相色譜的洗脫條件如表1所示。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.4.4 質譜條件

離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，質譜掃描模式采用多反應監測，離子源溫度：100 ℃，脫溶劑溫度：350 ℃，毛細管電壓：4 000 V，脫溶劑氣流速：11 L/min，定性離子對(m/z)：487>210，定量離子對(m/z)：487>241，錐孔電壓：110 V，碰撞能量：15 eV。

1.4.5 特異性

分析空白奶樣(n=20)，觀察在藥峰出現的區域是否有干擾。

1.4.6 標準曲線

分別設置7個不同濃度的標準工作液，依次為50、100、200、400、600和1 000 μg/kg，依據設定濃度加入標準品，添加頭孢噻呋于空白牛奶樣品中，按照前述方法進行提取、凈化、復溶，HPLC-MS/MS檢測，以所得峰面積為縱坐標，相應的濃度為橫坐標繪制基質標準曲線，得到相應的基質標準曲線回歸方程與相關系數。

1.4.7 方法的檢出限(LOD)與定量限(LOQ)

采用最常見的檢出限與定量限的確定方法，即信噪比(S/N)法：分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢出限和定量限。

1.4.8 方法的準確度與精密度

用添加回收試驗驗證方法的準確度，用回收率表示準確度。按照前述“1.4.2”方法處理樣品，選擇LOQ(50 μg/kg)、MRL(100 μg/kg)、2MRL(200 μg/kg)進行添加回收，每個濃度5個重復，進行3次單獨試驗。

按照前述“1.4.2”方法處理樣品，選擇LOQ(50 μg/kg)，2LOQ(100 μg/kg)，10LOQ(500 μg/kg)，每個濃度5個樣品，重復測定3次，分別計算回收率和批內相對標準偏差以及批間相對標準偏差。

1.4.9 方法的穩定性

方法的穩定性包括反復凍融3次的穩定性，8 h室溫放置穩定性以及長期凍融穩定性。按照前述“1.4.2”方法處理樣品，選擇LOQ(50 μg/kg)、2MRL(200 μg/kg)進行添加回收，在樣品反復凍融3次前后、在前處理時(記為0 h)和處理后8 h以及長期凍融后檢測，分析藥物在牛奶中的穩定性。

1.5 數據處理與分析

每頭牛每個時間點分別取3個平行奶樣檢測，取其平均值作為最終檢測結果，應用WTM1.4軟件計算頭孢噻呋在牛奶中的棄奶期(WT)。

2 結果

2.1 特異性

分析不同來源的空白牛奶樣品，目標化合物的保留時間附近沒有雜質干擾，牛奶空白基質色譜如圖1所示。

圖1 牛奶空白基質特征離子質量色譜

2.2 標準曲線與檢測限以及定量限

在50～1 000 μg/kg的濃度范圍內，方法的線性關系良好，相關系數>0.99，頭孢噻呋的方法檢出限為25 μg/kg，其色譜如圖2所示，定量限50 μg/kg，其色譜如圖3所示。

圖2 頭孢噻呋衍生物DCA的檢測限色譜

圖3 頭孢噻呋衍生物DCA的定量限色譜

2.3 準確度

選擇50、100和200 μg/kg進行添加回收，每個濃度計算回收率，結果如表2所示，3個添加濃度的回收率為96.48%～100.19%，滿足《獸藥殘留試驗指導原則》[12]。

表2 加樣回收率結果 %

2.4 精密度

由表3可知，選擇50、100和500 μg/kg為添加濃度進行方法精密度考察，批內精密度為2.09%～11.22%，批間精密度2.36%～12.31%(RSD，變異系數)。結果滿足《獸藥殘留試驗指導原則》[12]。

表3 精密度試驗結果

2.5 穩定性

2.5.1 待測藥物在凍融過程中的穩定性

由表4可知，添加50和200 μg/kg的頭孢噻呋標準品在牛奶樣品凍融過程中，待測物的變異系數為10.39%和12.67%。

表4 待測藥物在凍融過程中的穩定性

2.5.2 待測藥物室溫放置8 h穩定性

由表5可知，添加50 和200 μg/kg頭孢噻呋標品進行前處理后，室溫放置8 h穩定性檢測，待測物的變異系數為10.08%和8.48%。

表5 待測藥物室溫放置8 h的穩定性

2.5.3 待測藥物在牛奶中的長期穩定性

由表6可知，分別添加50 和200 μg/kg的頭孢噻呋標準品于牛奶中混勻，分別在冷凍當日(記為0)和冷凍1月進行前檢測，分析待測藥物在牛奶中的穩定性，變異系數分別為7.47%和8.08%。

表6 待測藥物在牛奶中的長期穩定性

2.6 牛奶中頭孢噻呋鈉的濃度

按照本研究建立的方法，對采集的牛奶樣品進行檢測。在第1次給藥后4和12 h，牛奶中去呋喃甲酰基頭孢噻呋的殘留量均低于規定的MRL(100 μg/kg)，且大多數采樣點的殘留量低于定量限(LOQ=50 μg/kg)。連續3 d給藥后，對所有奶牛在給藥后4、8、10、12和24 h采集奶樣進行殘留分析，其中18頭奶牛的奶中去呋喃甲酰基頭孢噻呋的大多數都低于定量限，也小于規定的MRL，這表明頭孢噻呋鈉在奶牛體內代謝快。其中3087號奶牛在第3次給藥后10 h以及3513號奶牛在第3次給藥后4 h去呋喃甲酰基頭孢噻呋的濃度分別為113.79和166.10 μg/kg，高于MRL，其余奶牛在所有采樣點的濃度均低于MRL。這表明奶牛體內殘留消除存在差異性，可能和個體體態等因素有關。

2.7 牛奶中頭孢噻呋鈉的休藥期

頭孢噻呋鈉的MRL為100 μg/kg，通過WTM1.4軟件計算注射用頭孢噻呋鈉的棄奶期為7.148 h，棄奶期結果如圖4所示。

圖4 頭孢噻呋鈉在牛奶中的殘留消除規律

3 討論

頭孢噻呋屬于β-內酰胺類抗生素，主要用于治療禽畜的細菌性呼吸道感染等疾病，臨床效果好，優于傳統的磺胺、氯霉素、慶大霉素及恩諾沙星、泰樂菌素、氟苯尼考等，無任何明顯的毒副作用，耐藥率相對較低[13-14]，應用范圍廣。因此，對該藥物在食品動物中的殘留檢測就顯得尤為重要。

HPLC-MS/MS方法因其具有良好的適用性和高靈敏度，常在抗生素殘留檢測中發揮重要的作用[15-16]。本研究建立了頭孢噻呋在原料奶中的藥物殘留HPLC-MS/MS檢測方法，經過梯度洗脫，優化色譜、質譜條件，優化了國家標準方法中固相萃取柱的選擇，樣品只需經過C18萃取柱1次，簡化了之前方法中繁瑣的過柱程序，操作簡單。其色譜峰的保留時間在3 min左右，峰形尖銳，兩邊對稱，并對其進行了方法學考察，方法靈敏度好，回收率高，檢測限可達25 μg/kg，滿足國內外對于該藥的檢測要求[17]。

對于所有肌肉注射給藥的奶牛，按照試驗設計的采樣點進行殘留分析，除1頭奶牛在第3次給藥后10 h以及1頭奶牛在第3次給藥后4 h去呋喃甲酰基頭孢噻呋的濃度分別為113.79和166.10 μg/kg，其余奶牛在所有采樣點的濃度均低于最大殘留限量。 由以上數據可看出，奶牛按照推薦劑量給藥后，牛奶中殘留標識物去呋喃甲酰基頭孢噻呋消除較快。據報道，給奶牛肌肉注射2.2 mg/kg的14C-頭孢噻呋，在最后一個劑量后10 h牛奶中殘留量最多，殘留量為71 μg/kg，到12 h降到40 μg/kg[5]。本研究中相同時間點殘留量略有不同，但在最后一次給藥后12 h殘留量都低于定量限，也低于最大殘留限量，這可能與奶牛的個體差異有關，但是總體殘留消除趨勢與國外其他報道基本相符[5,18]。除去異常值，包括殘留最高點在內的各個時間點殘留量均低于我國農業部規定的最大殘留限量。

國外對于頭孢噻呋的研究已經證明，頭孢噻呋殘留量低，高效安全，FDA已經確定其無牛奶棄奶期[19]。但是我國缺乏該藥在牛上的殘留數據，也沒有相關棄奶期的規定。基于此，我們進行了注射用頭孢噻呋鈉在牛奶中的殘留消除試驗，以期了解該藥物在牛奶中的殘留消除規律并制定休藥期。通過WTM1.4軟件計算注射用頭孢噻呋鈉在牛奶中的棄奶期為7.148 h。為了確保動物食品安全，防止個體差異，以及考慮到臨床實際操作等，參考標準以及本次試驗的結果，建議將注射用頭孢噻呋鈉的棄奶期定為12 h。

綜上，本研究建立的注射用頭孢噻呋鈉的HPLC-MS/MS檢測方法，特異性強、回收率高、重復性好，檢測限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg，滿足頭孢噻呋鈉在牛奶中的殘留檢測要求。根據其殘留消除規律建議頭孢噻呋鈉在牛奶中的棄奶期為12 h。