鴿乳中產纖維素酶和脂肪酶微生物的分離鑒定

朱建國，嚴璐，劉雙倩，龔道清*，劉穎，謝鵬*

(1. 揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225125；2. 淮陰師范學院生命科學學院，江蘇 淮安 223001)

鴿子屬于晚成雛鳥類，其嗉囊組織在結構和功能方面與其他禽類不同，除儲存和軟化食物外，還承擔著類似于哺乳動物乳腺的“泌乳”功能。剛孵化的幼鴿由于不具備覓食能力，必須依靠親鴿嗉囊形成的 “鴿乳(crop milk)”作為唯一營養來源[1]。鴿乳是由親鴿嗉囊的上皮細胞層脫落形成，含有豐富的營養物質、免疫球蛋白、促生長因子等，對乳鴿的生長發育、機體免疫力和腸道微環境等起重要作用[2-3]。早期鴿乳的主要成分為蛋白質和脂肪，此外還包括少量的碳水化合物和礦物成分，隨著幼鴿日齡的增長，其外觀形態和營養成分均出現動態變化，自然狀態下，0～5 d鴿乳為淡黃色乳酪狀，5～7 d開始變為流質性液體并帶有發酵軟化的半顆粒狀飼料[3]，乳鴿發育中后期飼料及碳水化合物的比例需不斷增加。研究表明：乳鴿采食鴿乳至3周齡，體重會增長近22倍，然而幼雛剛出殼不久，胰腺及小腸黏膜自身分泌的消化酶活性較低，消化道發育尚不健全[4-7]。Shetty等[4]發現鴿乳中存在多種微生物，已有研究證實微生物可通過產生相關酶類來提高宿主的消化能力[8]，由此推測鴿乳中可能存在此類微生物，幫助雛鴿消化營養物質，使其腸道能夠適應高含量蛋白和脂肪的鴿乳[3]。此外，已發現鴿乳中富含半乳糖酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酸轉肽酶，脂肪酶和蛋白酶等也在脫落的嗉囊上皮細胞中持續積累，幼鴿依靠這些酶類進一步促進自身消化功能的發育[4, 9]。雖然有關人工仿制鴿乳的研究多見報道，但大都并未取得良好的替代飼喂效果，除人工配制技術尚不成熟外，未充分了解微生物在其中的作用可能也是原因之一[10]。鑒于此，本試驗將采集哺育期的鴿乳樣品，通過富集培養、初篩、復篩以及發酵培養，以期篩選出鴿乳中部分產酶微生物并對其進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取7、8日齡乳鴿各3只，鴿乳取樣方法參考文獻[11]，具體操作如下：用酒精擦拭消毒乳鴿嗉囊無血管處，使用手術刀片小心切開(手術刀消毒)，迅速收集鴿乳并裝入10 mL 無菌離心管中，迅速置于4 ℃冰箱保存。立即縫合乳鴿傷口并移入窩中，將采集的鴿乳充分混合并稱取5 g樣品，供產酶菌株分離用。

1.2 培養基制備

產纖維素酶微生物培養基包括：富集培養基、剛果紅培養基、搖瓶發酵培養基和保藏培養基，培養基成分參照文獻[12]；產脂肪酶微生物培養基包括：富集培養基、溴甲酚紫培養基、底物溶液、種子培養基和發酵培養基，培養基成分參照文獻[13]。以上培養基使用前均需121 ℃滅菌20 min；底物溶液：大豆油和2%聚乙烯醇體積比為1∶3，混合后4 ℃靜置1 h后高速勻漿5 min，現配現用。

1.3 樣品處理

將采集的鴿乳樣品加入到盛有45 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，置于搖床中，150 r/min，振蕩l h，讓鴿乳與生理鹽水均勻混合，使產酶微生物懸浮于生理鹽水中，振蕩結束后靜置15 min，備用。

1.4 產纖維素酶微生物的初篩、復篩及發酵

選用剛果紅篩選培養基，利用菌周圍出現透明圈現象來判斷該菌種是否為產纖維素酶的菌種，其透明圈面積大小可以反映其產酶能力的高低。吸取5 mL振蕩完畢的懸浮液，無菌接種到盛有45 mL富集培養基的三角瓶中，35 ℃恒溫搖床中培養1～2 d，期間觀察培養基的富集程度，然后稀釋涂布于剛果紅篩選培養基，35 ℃恒溫培養2 d，期間觀察菌落的生長狀況，挑選符合預期的菌種進行復篩與純化。

選取透明圈明顯的菌種復篩劃線培養2～3次，隨后挑選明顯的單菌落，無菌操作挑取菌落，一半接種于牛肉膏蛋白胨培養基(斜面保種)，另一半繼續劃線于篩選培養基并使其傳代5次以上。隨后采用測量相對酶活的方法來評估其是否產酶，對能產生透明圈且酶活性較高的菌落進行鑒定。

挑取復篩分離菌種的單菌落，無菌操作挑入盛有發酵培養基的三角瓶中，150 r/min，37 ℃震蕩培養48 h，隨后測定產酶活性。

1.5 產脂肪酶微生物的初篩、復篩及發酵

采用溴甲酚紫顯色培養基，根據菌種周圍出現黃色透明圈，以此判斷其為產脂肪酶菌種。吸取5 mL懸浮液，無菌接種到盛有45 mL富集培養基的三角瓶中培養24 h，隨后稀釋至10-4，各取0.2 mL涂布于溴甲酚紫顯色培養基，37 ℃恒溫培養48～72 h。觀察菌落的生長情況及有無透明圈，并記錄。

挑取初篩平板上透明圈明顯的菌株進行復篩，劃線培養2～3次，觀察菌落生長狀況，選取周圍仍有透明圈的菌種測定酶活力，對能產生透明圈且有較高酶活力的菌落標號，并鑒定。

挑選復篩分離菌的單菌落至裝有5 mL種子培養基的試管中，編號，在上述1.4條件下培養18 h之后，取0.5 mL接于4.5 mL發酵培養基試管中，混合均勻并標號，150 r/min，37 ℃，培養48 h后測定脂肪酶酶活。

1.6 酶活力的測定

1.6.1 羧甲基纖維素(CMC)酶活力的測定

CMC酶活力測定方法參考文獻[12]：發酵酶液0.5 mL， 1%的CMC 0.5 mL為底物(40 ℃預熱10 min)，40 ℃保溫反應30 min，加入3, 5二硝基水楊酸(DNS)3 mL，沸水浴5 min，冷卻后在540 nm下測定吸光值，取3個平行樣品(3支樣品管、1支空白管)OD值的平均值，根據葡萄糖標準曲線[12]求出葡萄糖含量。1 h內催化底物CMC-Na形成1 mg還原糖所需的酶量為1個酶活力單位。公式：

其中，M：根據標準曲線得出產生葡萄糖含量(mg)；N：酶液的稀釋倍數;T：反應時間。

1.6.2 濾紙酶活力的測定

取1 mL發酵酶液，分別加入pH值為4.8、0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL，0.05 g濾紙，40 ℃預熱5 min后再保溫反應1 h，之后加入DNS 3 mL，沸水浴10 min，流水冷卻后在540 nm下測定吸光值，同時滅活發酵液做空白對照；根據吸光值參照葡萄糖標準曲線求出相應的葡萄糖含量，按公式計算：

其中，X：濾紙酶酶活力，單位U/mL；W：葡萄糖的濃度；N：酶液稀釋總倍數；T：反應時間；M：樣品的體積。

1.7 脂肪酶(LPS)活力測定

LPS活力方法按照LPS試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書測定，以U/gprot表示酶活。具體操作如下：分光光度計于420 nm處，1 cm光徑玻璃比色皿，用Tris鹽酸緩沖液調零；將底物緩沖液37 ℃預溫5 min以上；在相應編號的試管中加入50 μL待測發酵液，吸取已預溫好的底物緩沖液2 mL沖入試管中，快速混勻，并計時；迅速倒入比色皿中，在分光光度計420 nm處比濁，30 s時讀取吸光度值A1；將此比色液倒入原試管中置37 ℃準確水浴10 min，再迅速倒入比色皿中，10 min 30 s時讀取吸光度值A2；求出2次吸光度差值(ΔA=A1-A2)。

標準管吸光值(As)：樣品緩沖液2 mL，生理鹽水50 μL，420 nm處比濁，讀取吸光值，此值相當于標準管濃度(454 μmol/L)的吸光值。

單位定義：在37 ℃條件下，每1 mL發酵液在本反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位。計算公式：

1.8 PCR擴增及同源性分析

引物設計及測序工作均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。提取各菌株的基因組DNA，PCR擴增其16S rDNA片段，切膠回收并純化PCR產物，經測序得到各菌株的16S rDNA序列，在GenBank中作同源性檢索并利用MEGA4.0軟件分析構建系統發育進化樹。

1.9 數據分析

酶活力測定結果取3個樣品重復的平均值，以“平均值±標準誤”表示。

2 結果

2.1 產酶菌落的形態觀察

在篩選培養基上發現了多個生長良好的菌落，通過復篩，最終挑選了4種菌落形態不同且酶活力較高的菌株作為目的菌株，編號XIAN1，XIAN3，XIAN2，XIAN4；產脂肪酶挑選ZHI1作為目的菌株。XIAN1菌落邊緣薄中間厚，中間呈白色，不透明，形狀圓形或橢圓形，山丘狀(圖1A)；XIAN2的菌落因聚集剛果紅而呈現出紅色或淡紅色，菌落呈顆粒狀(圖1B)；XIAN3在剛果紅選擇培養基上并不明顯，菌落色澤略呈淡黃色(圖1C)；XIAN4菌落呈白色實心狀，圓形，表面光滑，油滴狀(圖1D)；ZHI1在溴甲酚紫培養基上略呈藍白色，菌落較小(圖1E)。

A～D. XIAN1、XIAN2、XIAN3、XIAN4的剛果紅培養基觀察；E. ZHI1的溴甲酚紫培養基觀察

2.2 菌株產酶活力

對篩選分離的產纖維素酶及產脂肪酶共5個菌株分別進行了酶活力測定。結果如表1所示，篩選出的5種菌都具有較好的產酶能力。

表3 酶活力結果

2.3 菌株的PCR擴增

PCR擴增其16S rDNA片段，得到大小1 100 bp左右的DNA片段，如圖2所示。

2.4 產酶菌株的測序及同源性比較

結果如圖3所示:XIAN1為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，XIAN2為大腸桿菌(Escherichiacoli)，XIAN3為吉氏庫特菌(Kurthiagibsonii)，XIAN4為克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，ZHI1為變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。

M. Marker; 1. XIAN1;2. XIAN2;3. XIAN3;4. XIAN4;5. ZHI1

注：比例尺表示該遺傳距離下序列之間的差異度為2%，黑色邊框為分離的產酶菌

3 討論

微生物在動物生長代謝的過程中扮演了十分重要的角色，不僅在調節宿主腸道微生物組成和能量攝入方面起著重要作用，其代謝產物還可以調節宿主體內營養代謝平衡、改善宿主腸道內的營養水平以及增強腸上皮屏障功能[14-15]。親鴿將嗉囊內的鴿乳飼喂給幼鴿的過程中將相關微生物傳遞給幼鴿，從而有助于幼鴿腸道微生物的建立[3]。人類嬰幼兒腸道微生物的建立得益于母乳中的益生元，而 Shetty 等[16]檢測到了在第7天的鴿乳中亦存在一類潛在的益生元，并通過試驗證實其可使雞盲腸乳酸菌群發生變化，此外，IgA、IgG等免疫球蛋白廣泛存在于鴿乳中，由此可以推測，幼鴿是通過攝入鴿乳建立與調節體內的微生物種群及提高免疫能力。

鴿乳是由哺育期親鴿的嗉囊上皮細胞脫落所形成的乳酪狀物質，并以4 h為周期不斷往復形成，隨著雛鴿的發育，鴿乳外觀及營養成分比例會出現較大變化。本試驗篩選分離的產纖維素酶菌種，酶活力相對較低。作者認為這是由于早期鴿乳成分主要為蛋白質和脂肪，以及碳水化合物含量很低的原因，而哺育期后期，其比例逐漸增加[9]，產纖維素酶微生物種類和酶活力可能出現不同，這有待于后續進一步研究。而哺育期前期因脂肪含量較高，所以產脂肪酶分離菌的酶活力相對較高。

本試驗分離出的XIAN1、XIAN4、XIAN2均為條件致病菌[17]。XIAN1為銅綠假單胞菌，革蘭陰性好氧菌，主要通過種蛋污染、皮膚劃傷、呼吸道及消化道途徑感染宿主，并在一定條件下使其發病[18]，如羊群的化膿性肺炎、雞的敗血癥等，死亡率在1%～90%以上[19]；XIAN4為肺炎克雷伯氏菌，革蘭陰性桿菌，兼性厭氧，主要通過消化道傳播，可引起哺乳動物肺炎、子宮炎、腹瀉等疾病[20]；XIAN2為大腸桿菌，是一種自然界常見的腸道寄居菌，在特定條件下可誘發多種動物的腸道感染，尤其雞、豬對此最為敏感[21]，可通過糞便途徑傳播。21世紀以來，隨著養殖業規模的日益擴大，由條件致病菌引起的疾病有愈發嚴重的趨勢，尤其是幼年動物，由于其免疫抵抗能力較弱，更容易感染此類菌，因此，在養殖過程中要加強飼養管理，及時清掃糞便，加強對環境的消毒，保持圈舍清潔衛生，采用優質飼料，保證飼料安全衛生等。

本試驗篩選出的產酶菌多為條件致病菌，但在樣品來源地實際生產中尚未發現疾病案例。上述產酶菌可能通過酶解底物為自身生存提供必要的能量和營養物質，同時也促進了宿主的消化吸收能力。目前國內有關動物體內產纖維素酶分離菌的報道以芽孢桿菌居多，如朱亞靜[22]、張慶芳等[23]分別從鵝腸道及牛瘤胃中分離出高產纖維素酶的芽孢桿菌；韓生義等[24]從牦牛瘤胃中分離出高產脂肪酶的沙雷氏菌，同樣為條件致病菌。此外已有研究發現肺炎克雷伯氏菌能夠產菊粉酶、果膠酶、普魯蘭酶等[25-27]，可見該菌產酶種類具有多樣性，而變棲克雷伯氏菌除具有脂肪酶活性之外還具備固氮酶活性[28]，雖同屬于克雷伯氏菌,但其產酶種類并不完全相同，不同亞種之間基因序列的差異可能是導致這種變化的原因。吉氏庫特氏菌具有產纖維素酶能力則為本試驗首次發現。此外，本試驗測序過程中發現大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變棲克雷伯氏菌具有多個突變位點，其產酶能力可能由此致使。

綜上，本次試驗中所分離出4種產纖維素酶和1種產脂肪酶細菌，其中銅綠假單胞菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變棲克雷伯氏菌均為條件致性病菌，對乳鴿的生長發育是否有益及其具體作用還有待于進一步研究，本試驗研究將為鴿子腸道微生物種類以及產酶微生物的研究及應用奠定基礎。