新型鵝星狀病毒ORF2基因的原核表達及多克隆抗體的制備

張碩，謝軍，顧玲玲，方馨慧，嵇珊珊，陶靜，朱善元*，陳麗，王安平*

(1. 江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2. 江蘇海洋大學江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；3. 江蘇農牧科技職業學院江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300；4. 江蘇海洋大學江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇 連云港 222005)

星狀病毒是一種無囊膜、單股、正鏈RNA病毒，病毒衣殼呈二十面體結構對稱，直徑約30 nm，全長約6.1～7.9 kb。基因組包括5′非翻譯區、3′非翻譯區、3個開放的閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2)和1個多聚腺氨酸poly A尾[1]。3個開放的閱讀框分別編碼非結構蛋白、RNA依賴RNA聚合酶和衣殼蛋白。其中ORF2閱讀框編碼的病毒衣殼蛋白是病毒的抗原決定蛋白，能刺激機體產生免疫應答，是誘導機體產生保護性抗體的主要抗原[2]。

近年來，我國華北、華中、華南等多地鵝場暴發了一種以關節痛風和內臟痛風為主要特征的致死性傳染病[3-5]。該病主要侵害5～20日齡的雛鵝，病鵝內臟器官表面及關節腔內部會產生大量白色尿酸鹽沉積，死亡率可高達50%，對我國養殖業經濟發展造成了嚴重的威脅[6-11]。造成鵝痛風的原因有很多，如：飼料蛋白水平不均衡、飼養環境不佳、腸道菌群失衡或星狀病毒感染等[12-13]。但是在一些飼喂合理、環境溫暖、干燥、保溫性能好、空氣流通、養殖密度合適的鵝場依然會出現痛風現象，因此懷疑此種痛風是由一種新型鵝星狀病毒(goose astrovirus, GAstV)感染引起的[14-17]。

近年來國內外關于新型鵝星狀病毒的報道逐漸增多，如目前已報道的分離株SD01、SDPY、JSHA株等[9, 18-19]。張清水[2]利用SD01毒株進行了健康雛鵝感染試驗，Yang等[16]通過NGS技術對SDPY株進行全基因組測序，徐蓉等[9]驗證了該毒株可感染鵝胚腎臟上皮細胞，姜勝男等[18]對山東部分地區新型鵝星狀病毒ORF2基因進行了擴增并繪制了遺傳進化樹，但均未對星狀病毒及其結構或功能蛋白進行更加深入的研究。本研究利用大腸桿菌表達系統表達新型鵝星狀病毒結構蛋白ORF2基因，制備其多抗血清，為新型鵝星狀病毒檢測方法的建立及相關功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌種與細胞

本實驗室自行分離鑒定的新型GAstV毒株YC20，GenBank序列號為MW536497；鵝抗GAstV陽性血清為此病毒攻毒雛鵝后康復鵝血清；10日齡鵝胚購于江蘇省金鵬鵝業有限公司；pET-30a載體、雞肝癌細胞(LMH)由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室保存；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞購于大連TaKaRa公司。

1.2 酶類和試劑

核酸提取試劑盒、反轉錄酶、限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4 DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司；質粒抽提試劑盒、His柱純化試劑盒、His組氨酸單抗、DAB顯色試劑盒均購自康為世紀公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG、HRP標記的羊抗鴨IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG、熒光素標記的山羊抗兔IgG購自美國KPL公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中公布的新型GAstV基因組序列，設計1對針對ORF2基因序列的特異性引物，由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。引物序列為：GAstV-F:5′-TAAGGATCCATGGCAGACAGGGCGGTGGC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點);GAstV-R:5′-ATACTCGAGTCACTCATGTCCGCCCTTCTC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。

1.4 病毒增殖與RNA提取

取新型GAstV YC20 經尿囊腔接種10日齡鵝胚，棄去24 h內死亡的鵝胚，并在接種5 d后收取鵝胚尿囊液。參考核酸提取試劑盒說明書提取尿囊液總RNA，-80 ℃保存備用。

1.5 ORF2基因的擴增

根據RT-PCR反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄操作，RT的程序為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。PCR反應程序為：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 mim，35個循環后12 ℃保存。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 重組表達載體pET30a-ORF2的構建

將PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按膠回收試劑盒的說明書回收目的片段，經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切回收后，與同樣經過BamHⅠ、XhoⅠ酶切的pET-30a質粒22 ℃連接1 h。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于含有100 μg/mL卡那青霉素(Kan)的LB瓊脂平板上，37 ℃培養過夜。隨機挑取疑似單菌落，經PCR鑒定后提取質粒，進行瓊脂糖凝膠電泳篩選，并用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切進行鑒定。鑒定結果正確后送至江蘇金唯智生物技術有限公司測序，測序正確的克隆命名為pET30a-ORF2。

1.7 pET30a-ORF2蛋白的誘導表達及可溶性分析

將鑒定正確的pET30a-ORF2重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取單菌落接種于新鮮含100 μg/mL卡那抗性的LB液體培養基中，37 ℃培養過夜。次日將過夜培養物按1∶100接種于5 mL含卡那抗性的LB液體培養基中，37 ℃震蕩培養至OD600值為0.6～1.0之間時，加入1 mol/L的IPTG進行誘導，使IPTG終濃度為1 mmol/L，置于37 ℃搖床繼續震蕩培養3～5 h，離心收集菌體，沉淀溶于200 μL PBS中，超聲波裂解后離心，分別收集上清及沉淀，于-20 ℃保存備用。同時設置pET-30a載體質粒轉化BL21(DE3)感受態細胞同步誘導作為空白對照。

1.8 pET30a-ORF2蛋白的鑒定

誘導后，取100 μL菌液與100 μL 2×SDS上樣緩沖液混勻后，沸水煮沸3 min，進行SDS-PAGE分析。同時轉印至PVDF膜上，4 ℃、0.05 g/mL脫脂奶粉封閉過夜，分別以His組氨酸單抗(1∶1 000)、鵝抗GAstV陽性血清(1∶100)為一抗，37 ℃孵育2 h，以HRP標記的羊抗鼠(1∶5 000)、HRP標記的羊抗鴨(1∶5 000)為二抗，37 ℃孵育2 h，DAB顯色試劑盒進行顯色觀察。

1.9 pET30a-ORF2重組蛋白的純化

按上述1.7的方法重新誘導菌液100 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集菌體，加入2 mL PBS，超聲處理10 min，超聲后收集上清，按照His柱標簽蛋白純化試劑盒說明書進行純化操作，以200 mmol/L咪唑緩沖液進行洗脫，將洗脫液進行SDS-PAGE鑒定。

1.10 pET30a-ORF2多克隆抗體的制備

參照文獻[19]制備多克隆抗體血清，將上述純化的pET30a-ORF2重組蛋白，以背部皮下多點注射家兔，每只家兔免疫的蛋白量為300 μg，每隔2周免疫1次，前2次免疫后的第7天進行采血，第3次免疫后的第14天采血，分離血清，-20 ℃保存備用。

1.11 多克隆抗體的鑒定

1.11.1 Western blot鑒定

將表達的融合蛋白樣品和空載體pET-30a經SDS-PAGE后，轉印到PVDF膜上。4 ℃、0.05 g/mL脫脂奶粉封閉過夜，以制備的家兔多抗血清為一抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，以HRP標記的山羊抗兔為二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育2 h，DAB顯色。

1.11.2 間接免疫熒光(IFA)鑒定

參考文獻[20-21]，將分離得到的GAstV尿囊液感染LMH細胞，在感染48 h后棄去上清，PBS洗滌2次，用預冷的固定液(丙酮∶乙醇=3∶4)4 ℃固定5 min，PBS洗滌2次，以制備的家兔多抗血清為一抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌2次，以熒光素標記的山羊抗兔IgG為二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌2次后置于熒光倒置顯微鏡下進行觀察。同時以未接種的LMH細胞作為陰性對照。

2 結果

2.1 ORF2基因的克隆

以新型GAstV尿囊液為模板進行PCR，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，出現1條約2 100 bp大小的特異性條帶(圖1)，與預期相符。

M.DNA分子量標準；1. PCR擴增產物

2.2 重組表達載體pET30a-ORF2的構建與鑒定

將克隆的重組表達載體pET30a-ORF2經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后得到約2 100 bp和5 400 bp 2個條帶(圖2)，與預期結果相符，且DNA測序結果證明ORF2基因克隆正確。

2.3 pET30a-ORF2蛋白的誘導表達

將重組菌pET30a-ORF2用IPTG進行誘導表達，并以pET-30a載體質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞同步誘導作為對照。SDS-PAGE顯示，IPTG濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導6 h，重組蛋白可以得到較高水平的表達，上清和包涵體中均存在。重組蛋白的相對分子質量約為84 kDa(圖3)，與理論值相符。Western blot結果顯示，His組氨酸單抗(圖4)、鵝抗GAstV陽性血清(圖5)均能對重組蛋白特異結合。

M.DNA分子量標準；1. 質粒pET-30a BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切；2. 質粒pET30a-ORF2 BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切

M.蛋白質分子量標準；1. pET-ORF2重組蛋白未誘導破碎上清；2. pET-ORF2重組蛋白未誘導破碎沉淀；3. pET-ORF2重組蛋白誘導破碎上清；4. pET-ORF2重組蛋白誘導破碎沉淀

M.蛋白質分子量標準；1. pET30a-ORF2重組蛋白;2. pET-30a誘導產物

M.蛋白質分子量標準；1. pET-30a載體質粒;2. pET-ORF2重組蛋白

2.4 多克隆抗體的鑒定

2.4.1 Western blot鑒定

通過Western blot對制備的兔多抗血清進行鑒定，結果顯示(圖6)，在分子量約84 kDa處出現特異條帶，空白對照未出現，說明制備的兔多抗能與ORF2重組蛋白發生特異性反應，具有良好的反應原性。

M. 蛋白質分子量標準；1. pET-30a誘導產物;2. pET-ORF2表達的融合蛋白

2.4.2 IFA鑒定

通過IFA對制備的兔多抗血清進行鑒定，結果顯示，新型GAstV尿囊液感染的LMH細胞中有大量特異性免疫熒光(圖7A)，而未感染對照組未出現(圖7B)，說明制備的兔多抗血清能與GAstV尿囊液發生特異性結合。

A.感染新型GAstV的LMH細胞；B. 未感染新型GAstV的LMH細胞

3 討論

近年來，鵝痛風已成為影響鵝場生產的主要疾病之一。越來越多的研究證明鵝星狀病毒是導致鵝痛風的主要原因之一，且鵝星狀病毒又分為不同基因型，2018年后流行的主要為新型鵝星狀病毒[11]。ORF2基因編碼星狀病毒的衣殼蛋白，該蛋白在病毒入侵宿主細胞、病毒粒子包裝等過程中起關鍵作用，且可以刺激機體產生免疫應答，參與宿主的免疫反應[2]。由于鵝星狀病毒的研究相對較晚，目前還沒有成熟的鵝星狀病毒檢測用血清學方法及防控用生物制品。鵝星狀病毒感染日益嚴重，迫切需要建立檢測鵝星狀病毒抗原抗體的檢測方法，監測鵝星狀病毒在鵝群中的感染情況。本試驗以本實驗室自行分離的新型鵝星狀病毒YC20為模板，用pET原核表達系統表達重組蛋白ORF2。重組蛋白不僅能被組氨酸單抗特異識別，也能與鵝抗GAstV陽性血清發生特異性反應。由于無抗鵝二抗商品出售，本試驗用抗鴨二抗代替，取得了較好的反應結果。以上說明，本試驗表達的重組蛋白ORF2具有良好的反應原性，可以用作血清學檢測的抗原。

原核系統表達的外源蛋白，雖然缺少翻譯后加工，但依舊保持完整的抗原性，可以用于特定蛋白抗血清的制備。本試驗將原核表達重組蛋白純化后免疫家兔，制備多抗血清。Western blot和IFA結果均證明該血清不僅能與重組蛋白發生特異性反應，也能特異性結合新型鵝星狀病毒。以上說明制備的多抗具有良好的反應原性，能特異性識別新型鵝星狀病毒，將來可以用于檢測抗原的血清學方法的探索。

本研究通過大腸桿菌原核表達系統成功表達了新型鵝星狀病毒結構蛋白ORF2，并制備了多抗血清，均具有良好的免疫原性和反應原性，為鵝星狀病毒檢測方法的建立及疫苗的研發奠定了基礎。至于表達的重組蛋白及制備的多抗，能否與傳統的鵝星狀病毒抗原抗體發生交叉反應，能否起交叉保護作用，還需要進一步開展研究。