重組綿羊肺表面活性物質結合蛋白A的體外生物學活性檢測

李增強，趙寧，張彥兵，李珂兒，魏立翔，孫延鳴

(石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003)

在哺乳動物的肺泡表面覆蓋有一層肺表面活性物質的蛋白(surfactant-associated protein，SP)，SP分為 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D共4種，其中SP-A為親水的蛋白質，其含量在SP中約占50%，是肺泡表面的主要免疫防御和免疫調節分子[1]，主要由肺泡Ⅱ型(AT-Ⅱ)細胞合成，也可以通過細支氣管非纖毛上皮細胞(clara 細胞)和黏膜下層細胞分泌。SP-A是Ca2+依賴性的膠原凝集素成員，分子結構中均含有氨基N端區、膠原蛋白樣區、頸區和凝集素活性區(即糖識別區，CRD)4個結構域，其中凝集素區可介導凝集素與多種不同病原體(細菌、病毒、真菌等)表面的糖類物質結合，引起病原體的凝集。研究發現，結合病原體的SP-A能增強吞噬細胞活性，促進吞噬作用；此外，SP-A可與巨噬細胞膜上受體結合，調理巨噬細胞對病原體的吞噬[2]。以往研究證實，人的SP-A不僅能顯著增強IgG抗體介導的中性粒細胞對病原體的吞噬[3]，還能以抗體非依賴的方式促進中性粒細胞吞噬殺滅病原菌[4]。中性粒細胞受抗原刺激后能夠脫顆粒釋放一種具有降解毒力因子和殺菌功能的中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員[5]，NE能夠抑制肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)的生長[6]。研究證明，人的SP-A能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等細菌的生長，表現出明顯的抗菌活性[7-8]。此外，SP-A不僅在過敏反應和炎癥的消退過程中發揮重要作用[9]，還具有重要的抗病毒感染[10]和免疫調節功能[11]。

盡管人們對人和小鼠的SP-A有比較深入的研究，但對其他動物SP-A的研究報道較少。為此本實驗室利用真核表達系統表達重組綿羊SP-A，并發現SP-A能夠顯著抑制綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)的生長[12]。為了更深入探討綿羊SP-A的功能，本研究對重組綿羊肺表面活性物質結合蛋白A(rSP-A)的部分體外生物學活性進行了檢測分析，為進一步研究SP-A在綿羊體內的生物學特性以及將其作為抗菌制劑的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

綿羊由石河子大學動物科技學院實驗站提供；rSP-A按照王繼雪等[13]構建的重組綿羊SP-A畢赤酵母GS115真核表達系統誘導表達rSP-A，用His標簽的Ni-NTA樹脂純化表達產物，經SDS-PAGE鑒定、濃縮后凍存于-80 ℃冰箱備用。酵母抽提物為GS115/pPIC9K空載體表達的產物。Mo 1412株為臨床獸醫學實驗室保存菌種，與Mo Y-98標準株的同源性為98%；羊巴氏桿菌(CVCC3045)和肺炎鏈球菌(ATCC10015)由預防獸醫學實驗室饋贈。

1.2 主要試劑

牛腦心浸液(BHI)和支原體肉湯培養基購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；HEPES購自北京博奧拓達科技有限公司；對硝基苯胺購自上海麥克林生化科技有限公司；RPMI 1640培養基購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；馬血清、胎牛血清(FBS)和四肽底物(N-(methoxysuccinyl)-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilide)均購自Sigma公司；羊外周血中性粒細胞分離液試劑盒、羊外周血淋巴細胞分離液試劑盒和MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 rSP-A對NE活性的調節作用測定

1.3.1 標準曲線的建立

使用甲醇配制濃度為2 mmol/L的對硝基苯胺標準溶液，二倍倍比稀釋后(0.5～0.002 mmol/L)使用酶標儀測定各孔OD405值，甲醇作為空白對照；以標準液濃度為橫坐標、OD405值為縱坐標繪制標準曲線，生成回歸方程。

1.3.2 NE活性的檢測

參照文獻[6]，向RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清)中加入rSP-A，使其終濃度分別為0、10、20、40、80和160 μg/mL；頸靜脈采集綿羊抗凝血液，使用羊外周血中性粒細胞分離液試劑盒分離中性粒細胞，添加含rSP-A的細胞培養基制成細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL；Mo菌液(106CCU/mL)以12 000 r/min離心10 min后，收集菌體并按感染復數(MOI)為10∶1感染中性粒細胞。37 ℃、5% CO2條件下培養2 h后收集上清(含NE)，與等體積0.1 mol/L HEPES緩沖液(含0.5 mmol/L NaCl，pH=7.5)混合后移入96孔板；每孔加入等量四肽底物(200 μL反應體系)，37 ℃孵育5 min后用酶標儀測定菌液的OD405值，每孔重復3次。根據回歸方程計算NE水解四肽底物生成的對硝基苯胺濃度。

1.4 rSP-A對淋巴細胞增殖的影響

參照文獻[14]，使用羊外周血淋巴細胞分離液試劑盒分離淋巴細胞，用臺盼藍染色法檢測淋巴細胞活率后，體外培養于添加有rSP-A的RPMI 1640培養基，rSP-A終濃度分別為0、5、10、20、40和80 μg/mL；此外，另一試驗組還需添加植物血凝素(PHA)至終濃度為5 μg/mL，每組3個重復；37 ℃、5% CO2條件下培養24、48和72 h，終止培養前4 h每孔加入10 μL MTT溶液，4 h后離心棄上清，每孔添加110 μL Formazan溶解液，低速振蕩10 min后使用酶標儀測定各孔OD490值。MTT結果以刺激指數(SI)表示，即：PHA組OD490值/未刺激組OD490值。

1.5 rSP-A對Mo生長代謝和增殖的影響

參照文獻[15]，向Mo培養基中添加5%體積的0.4%酚紅指示劑和CaCl2(終濃度為5 mmol/L)，同時添加rSP-A至終濃度分別為0(用等量酵母提取物替代)、10、20和40 μg/mL，按照培養基與Mo菌液(106CCU/mL)體積比為4∶1的比例接菌，每組3個重復；37 ℃、5% CO2條件下培養0、1、3、5和7 d，使用酶標儀檢測各組Mo菌液OD550值，并參考文獻[16]測定Mo的菌落數。

1.6 rSP-A抗菌活性分析

參照文獻[17]，配制含CaCl2(終濃度為5 mmol/L)和rSP-A的腦心浸液肉湯(BHI)培養基，rSP-A含量分別為0(用等量酵母提取物替代)、40、80、120、160和200 μg/mL；按1%的接種量將巴氏桿菌和肺炎鏈球菌接種于上述培養基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養6、12和24 h，每組3個重復；各階段培養結束后，使用平板菌落計數法測定菌液的含菌量。

1.7 數據處理

使用SPSS 24.0軟件對試驗數據進行One-way ANOVA分析，試驗數據以“平均值±標準差”表示；P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 rSP-A對NE活性的調節作用

根據梯度稀釋的對硝基苯胺標準液濃度和OD405值繪制標準曲線(圖1)，得到回歸方程y=7.132 8x+0.027 2，回歸系數R2=0.994 5。

圖1 標準品線性回歸曲線

各濃度rSP-A組的NE活性分析結果(圖2)顯示，20、40、80、160 μg/mL rSP-A組的NE活性均顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)，隨著rSP-A濃度的升高，NE活性明顯增強，說明rSP-A可顯著增強Mo感染中性粒細胞釋放的NE活性。

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 rSP-A對淋巴細胞體外增殖的影響

MTT檢測結果(圖3)顯示，淋巴細胞體外培養24、48和72 h時，SI均隨培養液中的rSP-A濃度的增高而減小，且對照組的SI始終大于其他各組。培養24 h后，10 μg/mL組的SI顯著小于對照組(P<0.05)，20、40和80 μg/mL組的SI極顯著小于對照組(P<0.01)；培養48 h后,20、40 μg/mL組的SI顯著小于對照組(P<0.05)，80 μg/mL組的SI極顯著小于對照組(P<0.01)；培養72 h后，20、40、80 μg/mL組的SI顯著或極顯著小于對照組(P<0.05或P<0.01)，80 μg/mL組的SI極顯著小于20 μg/mL組(P<0.01)。結果表明rSP-A對淋巴細胞體外增殖活性具有明顯的抑制作用。

圖3 rSP-A對淋巴細胞體外增殖活性的影響

2.3 rSP-A對Mo生長代謝和增殖的影響

rSP-A對Mo代謝的檢測結果見圖4，培養1 d后，20與40 μg/mL組Mo菌液OD550值顯著低于對照組(P<0.05)；培養3、5和7 d后，各試驗組Mo菌液OD550值均極顯著低于對照組(P<0.01)，說明rSP-A對Mo的生長代謝有明顯的抑制作用。

圖4 rSP-A對Mo代謝的影響

Mo平板菌落計數結果(圖5)顯示，Mo活菌數隨培養時長的增加而增多。培養時間超過3 d時，各組菌液濃度出現了顯著性差異，rSP-A濃度越高，菌液濃度越低。培養3 d后，20與40 μg/mL組的Mo菌液濃度顯著低于對照組(P<0.05、P<0.01)；培養5 d或7 d后，各試驗組的Mo菌液濃度均顯著或極顯著低于對照組(P<0.05、P<0.01)。結果表明，rSP-A可明顯抑制Mo的體外增殖。

圖5 Mo平板菌落計數結果

2.4 rSP-A的抗菌活性分析

肺炎鏈球菌和巴氏桿菌體外培養6、12和24 h后的菌液濃度檢測結果(圖6和圖7)顯示，2種菌液濃度變化均呈先增后降的趨勢。對比各組菌液濃度差異可知，隨著rSP-A添加量的增多，2種細菌的菌液濃度均顯著或極顯著降低(P<0.05、P<0.01)；由此可知，rSP-A對致病性肺炎鏈球菌和巴氏桿菌均有明顯抗菌活性。

圖6 rSP-A對肺炎鏈球菌的抗菌活性

圖7 rSP-A對巴氏桿菌的抗菌活性

3 討論

當呼吸道受到病原菌侵襲并發生炎癥時，中性粒細胞便會發生聚集、活化及脫顆粒，釋放NE[18]。NE是一種絲氨酸蛋白酶，能夠破壞病原菌的結構，并促進吞噬細胞吞噬細菌，參與機體免疫防御。在NE活性檢測試驗中，不同濃度rSP-A與Mo感染的中性細胞共同孵育了2 h，由于rSP-A對Mo增殖具有抑制作用，從理論上來講，各組Mo數量可能會有差異，從而影響NE的釋放量，最終會影響試驗結果。但實際上，Mo在本試驗中的作用主要是刺激中性粒細胞釋放NE，雖然rSP-A對Mo具有抑制作用，但Mo生長極其緩慢且本試驗作用時間僅有2 h，所以rSP-A對Mo的作用很小，可忽略不計，不會干擾試驗結果。在本試驗中，rSP-A能顯著增強Mo刺激中性粒細胞釋放的NE的活性，提示rSP-A可能通過促進Mo介導的中性粒細胞的活化及NE的釋放，使得NE活性進一步增強，有助于病原體的清除。然而，NE在動物體內也是一種具有破壞性的蛋白溶解酶，可破壞自身正常組織的完整性，與許多疾病的病理過程密切相關[19]。SP-A與NE同是機體的免疫蛋白分子，在體內是否存在某種關系，是今后需要研究的課題。

MTT試驗結果表明，rSP-A能明顯抑制淋巴細胞的增殖。Borron等[20]采用D-甘露糖親和層析法從牛支氣管肺泡灌洗液中分離純化出天然SP-A，并使用氚化胸腺嘧啶核苷滲入法測定了該蛋白對人外周血淋巴細胞體外增殖的影響，結果證實了牛SP-A對淋巴細胞增殖具有明顯抑制作用。本試驗結果與之相似。

抗菌試驗證明，rSP-A對肺炎鏈球菌、巴氏桿菌均有明顯的抑制作用，該結果與張永紅等[21]報道豬SP-A的抗菌活性結果相似。近幾年，人們對SP-A的抗菌機制進行了研究，初步證實SP-A主要通過發揮調理素作用和對吞噬細胞吞噬/殺傷能力的增強作用，間接實現其抗菌作用[22]。此外，SP-A還具有直接抗菌作用，如SP-A可增強革蘭陰性菌細胞膜通透性，抑制細菌的增殖。

綿羊支原體肺炎在我國發病率較高，其病原Mo對大多數抗生素均不敏感，臨床治療效果不佳。Mo基因組小，其自身生物合成能力較弱，體外培養主要以培養液中的葡萄糖作為能量來源。Mo分解葡萄糖產生的酸會改變培養液的pH值，酚紅作為一種酸堿指示劑可根據溶液酸堿度發生顏色變化，使用酶標儀測定OD550值可間接反映Mo分解代謝葡萄糖的情況。本研究利用這一原理測定了rSP-A對Mo代謝的影響，結果發現rSP-A能夠顯著抑制Mo的生長代謝；同時應用平板菌落計數法檢測了不同時期各組Mo菌量，證實rSP-A能夠顯著抑制Mo的增殖。趙寧等[12]利用平板菌落計數法和熒光定量PCR技術也證實了rSP-A對Mo具有抑菌活性。那么，rSP-A是通過抑制Mo的代謝而發揮其抑菌作用，還是其對Mo的抑菌作用導致Mo代謝減弱，這也是今后要深入探討的問題。

呼吸系統疾病是阻礙養羊業健康發展的主要疾病之一，本試驗選擇了羊的肺炎鏈球菌、巴氏桿菌和Mo為試驗對象，這是因為上述致病菌均是羊呼吸系統疾病的常見病原，為將來SP-A被開發為一種抗菌制劑廣泛應用于羊的呼吸系統疾病的防治奠定基礎。