非洲豬瘟病毒逃逸抗病毒干擾素相關天然免疫應答的研究進展

羅佳，倪敬花，姜森，肖延昭，朱建中

(揚州大學獸醫學院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心/農業與農產品安全國際聯合研究實驗室，江蘇 揚州 225009)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是一種對家豬和野豬具有毀滅性打擊的疾病，死亡率高達100%。目前世界上沒有有效的疫苗，動物屠宰和區域檢疫是控制該病的唯一方法，沒有其他有效措施來控制疫情的蔓延，ASF給世界各國養豬業都造成了巨大的經濟損失[1-3]。自從上世紀20年代在肯尼亞首次發現ASF以來，該病在非洲大陸迅速傳播，并一直存在于撒哈拉以南非洲國家。1957年，ASF首次傳播到歐洲，并一直在西班牙和葡萄牙流行，直到上世紀90年代中期才根除。ASF還傳播到其他歐洲國家以及加勒比國家(古巴、多米尼加共和國和海地)和巴西，其中撒丁島自1982年以來一直流行該病，除了撒丁島外，上述國家均已根除該病[4]。自2007年以來，由于航運廢物處理不當，ASF被引入格魯吉亞共和國，隨后蔓延到包括亞美尼亞、俄羅斯在內的東歐國家[5-6]。2017年，西伯利亞靠近中俄邊境地區發生了多起ASF疫情[7]。而在2018年8月3日，非洲豬瘟首次在中國暴發，中國養豬業面臨一場前所未有的災難和挑戰[8]。

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的，ASFV是一種大型、復雜的細胞質雙鏈DNA病毒，它不僅是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)家族的唯一成員，也是唯一蟲媒DNA病毒[9]。ASFV是一種大型的包膜病毒，其二十面體由內而外具有4個同心圓層:中心擬核、核心殼層、內包膜和二十面體衣殼[10]。ASFV的平均直徑約為200 nm，病毒基因組長度隨著分離株的不同存在差異，范圍在170～193 kbp之間,包含151到167個開放閱讀框架[11]。

ASFV必須在體內復制才能建立感染。面對宿主強大的免疫機制，它進化出一系列的免疫逃避機制來逃避宿主的免疫應答。天然免疫是宿主免疫防御的第一步，其中干擾素(interferons, IFNs)是至關重要的天然免疫抗病毒因子。本文就IFNs的免疫效應和ASFV免疫逃逸Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferon, IFN-Ⅰ)相關免疫應答及其機制進行簡要綜述。

1 干擾素與宿主抗病毒天然免疫

1.1 干擾素的分類

1957年，Isaacs和Lindenmann利用雞絨毛尿囊膜，觀察到一種細胞因子能明顯抑制流感病毒復制，并將之命名為IFNs。IFNs是一種廣泛表達的細胞因子，與宿主免疫反應密切相關，可以誘導有效抗病毒反應，抑制病毒復制。根據其細胞來源和理化性質可將IFNs分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 共3大類。 IFN-Ⅰ是重要的抗病毒細胞因子，主要包括α、β、ε、κ和ω這5種類型，而α有13種亞型，因此共有17種IFN-Ⅰ亞型。當病毒感染宿主時，宿主的天然免疫模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)，誘導一系列細胞內的信號級聯反應，引起IFN-Ⅰ基因轉錄和蛋白表達，并通過誘導大量的干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)表達，在細胞微環境中建立一種抗病毒感染狀態[12]。目前研究表明，ASFV主要影響IFN-Ⅰ的產生和作用來逃逸宿主的抗病毒反應。但是關于其他類型IFNs的報道卻很少。Ⅱ型干擾素也稱為IFN-γ，是一個重要的免疫調節因子，主要由NK細胞和T細胞產生，能夠增強抗原提呈，并促進NK和巨噬細胞的活化從而增強其吞噬功能，在免疫調節方面發揮著重要的作用[13]。Ⅲ型干擾素是IFN-λ，包括IFN-λ1、λ2、λ3、λ4亞型，IFN-λ同IFN-Ⅰ功能類似，也能誘導大量ISGs表達發揮強而有效的抗病毒作用[14]。由于IFN-λ由黏膜細胞表達分泌，能夠誘導抗病毒天然免疫應答，這意味著IFN-λ在黏膜免疫中發揮巨大作用。而ASFV主要通過呼吸道和消化道侵入機體，主要觸發黏膜免疫，能有刺激誘導大量的IFN-λ的產生，雖然目前還沒有明確的報道IFN-λ對ASFV的作用，但可以推測IFN-λ可能在ASFV抗病毒免疫中發揮巨大作用，也有可能是ASFV為了生存，通過某些方式拮抗了IFN-λ的產生機制，從而抑制IFN-λ的抗病毒反應。目前IFN-λ在ASFV感染過程中發揮的作用尚不清楚，有待于進一步研究。

1.2 干擾素的抗病毒作用機制

IFNs具備多種功能，主要有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用等。IFN-Ⅰ是發揮抗病毒作用的主要IFNs，能通過激活經典的JAK-STAT信號通路誘導多種ISGs的表達。ISGs是抗病毒作用的直接效應蛋白，不同的ISGs能夠針對病毒生活周期的各個階段并利用多種機制發揮作用，包括病毒入侵、脫衣殼、基因復制轉錄、蛋白翻譯和病毒顆粒釋放等方面。

ISG抑制病毒入侵：Mx蛋白具有非常廣譜的抗病毒活性，Mx蛋白除了能夠對許多RNA病毒有顯著抗病毒活性外，還能抑制大型胞質DNA病毒的復制，如ASFV[15]。人類細胞中有2種Mx蛋白，分別為Mx1和Mx2(也稱MxA和MxB)。Mx1能夠與病毒衣殼相結合，阻止病毒入侵細胞；Mx2能夠抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)殼侵入細胞核，從而阻止反轉錄基因組入核，阻斷HIV的復制。IFITM蛋白家族有4個成員：IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5，在抑制病毒進入細胞過程中也發揮作用。IFITM蛋白對其抑制的病毒表現出選擇性，比如：IFITM1可以抑制丙肝病毒(HCV)感染，但IFITM3不能[16]。

ISG抑制病毒蛋白質合成：病毒利用宿主的核糖體進行蛋白翻譯，合成各種蛋白進行和維持正常的生命活動。ISG蛋白能夠通過抑制蛋白質合成來阻斷病毒復制。蛋白激酶PKR識別病毒雙鏈RNA或中間體雙鏈RNA后會使翻譯起始因子2的α亞單位(eIF2α)磷酸化，導致病毒的蛋白合成阻斷，從而抑制病毒復制[17]。干擾素誘導的TRIM22則通過降解HCV非結構蛋白NS5A來抑制病毒的復制，也可以通過降低HBV的基因轉錄水平來抑制病毒蛋白合成及病毒復制[18-19]。

ISG抑制病毒的釋放：在病毒生命周期的后期，病毒核酸被包裝成衣殼，衣殼顆粒通過細胞裂解、胞吐或直接從質膜出芽離開細胞。Viperin蛋白通過抑制二磷酸合成酶(FBBS)從而抑制流感病毒和HIV的出芽[20-21]。另外Tetherin蛋白具有2個特殊的跨膜結構，能將HIV-1病毒粒子固定在細胞膜上，從而阻止病毒出芽[22]。

1.3 干擾素與細胞凋亡

IFNs在宿主抗病毒免疫反應中必不可少，其在限制病毒傳播方面具有重要的功能。之前研究表明IFNs發揮抗病毒作用主要表現在未感染細胞中建立抗病毒狀態，隨之發現IFNs在建立細胞抗病毒狀態的同時選擇性地誘導病毒感染細胞的凋亡。在病毒早期防御機制中，IFNs誘導產生的雙鏈RNA依賴的蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase, PKR)是促使病毒感染細胞凋亡的重要調節因子[23]。研究表明，一方面，PKR能通過磷酸化翻譯起始因子eIF2α誘導凋亡；另一方面，還通過NF-κΒ、p53多種信號通路來調控凋亡[24]。所以在病毒早期防御過程中，IFNs通過產生PKR引起感染細胞凋亡，抑制病毒的復制，從而發揮重要的抗病毒作用。

1.4 干擾素與抗原遞呈細胞的活化

在宿主免疫應答過程中，抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells, APCs)能夠攝取、加工和處理抗原并將抗原信息遞呈給T淋巴細胞。MHC類分子直接參與APCs對內源性和外源性抗原的遞呈過程。MHC Ⅰ類分子主要遞呈內源性抗原，MHC-I抗原肽復合物被CD8+T細胞識別；MHC Ⅱ類分子遞呈外源性抗原，MHC Ⅱ抗原肽復合物被CD4+T細胞識別[25]。IFNs在抗原呈遞的過程中也發揮著重要的作用，主要是通過調節MHC類分子的蛋白表達實現。IFNs能夠加速MHC類分子編碼基因的轉錄過程，并增強其表達。IFN-Ⅰ能增加抗原遞呈細胞尤其是樹突細胞(DCs)表達MHC Ⅰ類分子，并抑制MHC Ⅱ類分子表達，促進CD8+T細胞活化。IFN-γ不僅能使MHC Ⅰ類分子表達增強，還能誘導MHC Ⅱ類分子的表達，增強CD4+T和CD8+T細胞反應[26]。總之，IFNs通過上調MHC類分子的表達，促進抗原遞呈細胞的活化，增強其抗原遞呈作用，活化效應T細胞，使宿主處于最佳的免疫狀態。

2 ASFV逃逸抗病毒IFN相關天然免疫反應

目前已知ASFV可能逃逸IFN相關介導的天然免疫途徑：一是通過抑制IFN-Ⅰ的應答來逃避IFNs的抗病毒功能；二是在宿主免疫基因合成的過程中，干擾宿主免疫基因的轉錄和蛋白合成，有利于逃避IFN介導的免疫反應；三是ASFV能抑制感染細胞的凋亡，有利于病毒的復制；四是ASFV能夠損害重要APC的功能，影響宿主的免疫應答。

2.1 ASFV感染拮抗IFN-Ⅰ應答及其機制

TLRs作為最早發現的PRRs，為Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，由胞外區、跨膜區和胞質區組成，TLRs識別病毒PAMP后被激活，發生二聚化，啟動細胞內信號級聯反應，誘導細胞分泌IFNs、炎癥因子、趨化因子[27]。研究表明，ASFV I329L是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，富含329個氨基酸，包含17個信號肽(1～17 aa)，1個N-末端的胞外區(18～239 aa)，1個跨膜區(240～260 aa)，1個C-末端胞內區(261～329 aa)，與Ⅰ型跨膜糖蛋白TLR3結構類似，是TLR3 同源蛋白。能夠靶向接頭蛋白TRIF抑制TLR3誘導IRF3和NF-κΒ的活化(見圖1),從而抑制誘導IFN-β和趨化因子應答，進而逃避宿主抗病毒免疫應答[28-29]。

ASFV多基因家族MGF360和MGF530基因能促進受感染細胞的存活, 允許病毒在巨噬細胞中有效復制，并且與病毒的毒力密切相關[30]。其中，MGF360基因是ASFV感染蜱蟲宿主的重要的決定因子，是蜱蟲寄主中ASFV復制和擴大感染所必需[31]。已有研究表明，MGF360、MGF530除了抑制IFNs的誘導外，還能使ASFV克服細胞抗病毒狀態。作為MGF360的一員，A276R基因可以通過抑制天然免疫RNA受體TLR3和RIG-Ⅰ/MDA5下游的轉錄因子IRF3，抑制IFN-Ⅰ的產生，但對Ⅰ型和Ⅱ型IFN的JAK-STAT途徑和信號通路無影響。與A276R相比，MGF505家族成員A528R，不僅抑制TLR3和RIG-Ⅰ/MDA5下游的轉錄因子IRF3，而且抑制信號通路下游的NF-κΒ(見圖1)。此外，A528R除了抑制IFN-Ⅰ的產生，對Ⅰ型和Ⅱ型IFN的JAK-STAT途徑和ISGF3信號也起抑制作用[32]。研究表明ASFV MGF360和MGF530基因缺失株上調IFN-β的表達，病毒毒力下降，對豬進行免疫后，可誘導對親本病毒攻擊的保護性反應[33]。表明IFN逃逸基因缺失是構建合理減毒ASFV候選疫苗株的有效途徑。

DP96R(UK)表達于ASFV感染早期，蛋白序列保守，是ASFV毒力基因。DP96R能夠通過靶向TBK1抑制DNA受體cGAS-STING介導的IFN-Ⅰ的產生，同時也能抑制TBKI和IKKβ介導的NF-κΒ的活化(圖1)，最終實現免疫逃避。DP96R免疫逃逸可能通過其C端結構域發揮作用，提示我們可以通過缺失DP96R C端結構域來消除ASFV的免疫逃逸作用[34]。其他ASFV基因如K205R也能有效抑制IFN-β的表達，與免疫逃避有關，但是免疫逃避機制尚不清楚[35]。目前還需要通過大量篩選發現更多的IFNs免疫逃逸基因，并且弄清其免疫逃避機制。

注：紅色矩形框中是ASFV蛋白名稱，黑色圓圈中負號表示抑制作用

2.2 ASFV干擾宿主免疫基因轉錄和蛋白合成

ASFVA238L基因編碼蛋白是一種能夠影響宿主功能的蛋白，能夠同時存在感染細胞的胞質和核中，分子量存在差異，可能是由于翻譯后不同加工而造成。A238L的錨蛋白重復序列與IκΒ家族成員類似，因此被認為是IκΒ的同源蛋白，并且能夠可以像IκΒ一樣直接與NF-κΒ結合，抑制NF-κΒ的激活，阻止宿主基因轉錄并下調炎性因子的產生，干擾依賴NF-κΒ的抗病毒機制。A238L還抑制鈣神經磷酸酶的活性，與鈣神經磷酸酶結合干擾轉錄因子NF-AT的激活[36]。此外，A238L通過CBP/p300轉錄輔激活物的機制來抑制TNF-α轉錄[37]。因此，A238L可能通過干擾宿主免疫應答基因的轉錄激活，造成廣泛的免疫抑制。DP71L為ICP34.5類似物，它的C末端結構域與單純皰疹病毒的ICP34.5蛋白相似，能夠通過與機體內的蛋白磷酸激酶1(PP1)結合，導致真核生物翻譯起始因子2(eIF-2α)去磷酸化從而抑制宿主蛋白的合成，卻有利于病毒的合成和釋放[38]。

2.3 ASFV抑制感染細胞凋亡

病毒感染細胞時，感染細胞凋亡是宿主控制病毒感染的重要機制。多種因素可促發細胞凋亡，而IFNs是其中之一。ASFV進化出了抑制感染細胞凋亡的策略。 ASFV EP153R主要編碼一種非必需蛋白，具有C型凝集素樣的結構域，在病毒感染早期和晚期，蛋白都可表達。該蛋白主要參與ASFV感染細胞誘導的血液吸附過程，最近研究發現，EP135R含有細胞黏附區域并與細胞黏附和T細胞活化相關CD44分子顯著同源，能抑制ASFV感染時caspase-3的活化，從而抑制其誘導的凋亡[39]。研究建立了EP153R的三維模型表明，EP153R編碼的蛋白能夠抑制細胞表面MHC I分子的表達，并且還能抑制宿主細胞p53的活性，抑制細胞凋亡[40](圖2)。ASFV存在2種蛋白分別是IAP和Bcl2同源物，可以抑制感染細胞的凋亡，從而促進子代病毒粒子的復制。A224L基因編碼IAP樣蛋白，序列比較保守，表達在病毒感染晚期，該蛋白能夠通過與caspase-3蛋白水解酶片段相互作用，抑制水解酶的活性,并能夠激活NF-κΒ的活性。A224L還編碼了一種類似Bcl2分子具有抗凋亡的功能，從而促進病毒顆粒的形成[41](圖2)。而A179L基因編碼的Bcl2樣蛋白在感染早期和晚期均有表達，它包含Bcl2相關蛋白特征性的BH1、BH2和BH3高度保守結構域與促凋亡Bcl2家族蛋白相互作用抑制其細胞凋亡作用(圖2)。除此之外，A179L與Beclin 1在線粒體和內質網處共定位，并通過BH3同源結構域與Beclin 1相互作用來調控自噬[42]。前面提到的DP71L能夠并且能夠抑制促凋亡CCAAT增強劑結合蛋白同源蛋白(CHOP)的轉錄激活，起到抑制細胞凋亡的作用(圖2)。并且研究還進一步發現，ASFV感染宿主時，未感染淋巴細胞大量凋亡，降低了宿主免疫應答的有效性，有利于病毒復制[43]。

注：紅色矩形框中為ASFV蛋白名稱，紅色圓圈中負號表示抑制作用，正號表示促進作用

2.4 ASFV損害抗原遞呈細胞功能

巨噬細胞具有一定的吞噬能力，能吞噬殺死入侵機體的大多數病原體，在免疫調節，抗病毒和抗腫瘤等方面都發揮著重要的作用，除此之外，巨噬細胞還是重要的抗原遞呈細胞。ASFV感染巨噬細胞，并在其中大量復制、增殖，會對巨噬細胞產生損害，也是造成免疫逃避的重要原因之一。研究發現，ASFV感染巨噬細胞時，會下調巨噬細胞表面CD14和CD16的表達,損害了吞噬細胞的功能和抗病毒活性；另一方面，在體外ASFV感染巨噬細胞時，相對于強毒株L60，弱毒NH/P68能增強IFN-α、TNF-α和IL-12等細胞因子的表達[44]。這些表明強、弱毒株在感染巨噬細胞中存在差異，有可能強毒株可能進化出逃逸巨噬細胞細胞因子/趨化因子反應的機制。

樹突狀細胞在免疫反應中發揮重要作用，DCs能夠高效地攝取、加工和遞呈抗原。主要分為2類，第1類起源于髓系，包括cCD1s、 cCD2s；第2類為淋巴系樹突細胞pDCs，為天然免疫IFN-Ⅰ的主要產生細胞。ASFV會感染皮膚來源的DCs，感染后會嚴重損害DCs的功能，甚至造成樹突細胞的死亡，影響宿主的免疫反應。同巨噬細胞相比，ASFV感染DCs后未誘導IFN-β、IL-8和TNF-α等細胞因子的表達，病毒可能通過抑制細胞因子的轉錄，來逃逸DCs 細胞觸發的免疫反應[44]。

NKT細胞、rδT細胞也是抗原遞呈細胞，可是目前沒有明確的報道闡明這2種細胞在ASFV免疫應答中的作用。有研究表明，rδT細胞能夠誘導細胞因子和趨化因子的產生，包括IFN-λ，表明 rδT細胞在ASFV感染時能發揮天然免疫的作用。

3 前景與展望

ASF作為豬的一種烈性傳染病，給世界養豬業造成毀滅性的打擊。因此，對ASFV的免疫逃逸機制深入研究，對疫情防控工作有重大意義。ASFV編碼160多種蛋白，包含54種結構蛋白和100多種非結構蛋白，但大多數蛋白不是病毒復制所必需，但對ASFV在宿主體內的存活和傳播起著重要作用。目前已知功能的僅50多種，大多數蛋白的功能是未知。這些蛋白是否參與病毒免疫逃避過程需要進一步研究。

黏膜免疫是防止病毒感染的第一道防線，而非洲豬瘟主要通過消化道和呼吸道進入機體，首先觸發的應該是黏膜免疫。黏膜免疫中扮演重要角色的天然免疫抗病毒因子主要是IFN-λ，但是目前有關報道都集中在IFN-Ⅰ，對于IFN-λ在抗ASFV和ASFV逃逸IFN-λ方面卻知之甚少。具體來講，IFN-λ引發的免疫反應能否有效地抑制ASFV復制，以及在長期的進化中，ASFV是否編碼出相關蛋白來逃避IFN-λ觸發的黏膜免疫，以及如何有效利用IFN-λ來做好非洲豬瘟防控工作應該是今后工作的關注點。

總之，非洲豬瘟疫情形勢依舊嚴峻，隨著抗病毒藥物和試驗性疫苗應用，ASFV發生變異形成新的免疫逃避可能性極高。深入了解ASFV逃避宿主尤其是逃逸IFN免疫的機制，有助于闡明病毒與宿主的相互作用及ASFV的致病機理，為ASF的防控工作提供新的思路和方法。