基于GEO 數據庫及網絡藥理學探究古方黃芪散治療糖尿病腎病相關作用機制

牛海帆 馬寧

1 山東省濟寧市兗州區人民醫院內分泌科 272100；2 承德醫學院研究生院，河北067000

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是目前臨床內分泌科常見的糖尿病并發癥，除糖代謝異常外，還會出現水腫、蛋白尿等一系列腎小球濾過功能異常，占糖尿病并發癥的30%～35%［1］。隨著飲食及生活習慣改變，糖尿病發病率逐年上升，DN 已成為終末期腎臟病的首要原因，因此積極防治具有重要意義。蛋白尿是DN 診斷及治療效果評價的重要指標，但目前臨床尚缺乏降低蛋白尿的有效治療途徑［2］。

DN 屬中醫“消渴病”范疇，研究發現黃芪散能夠有效降低尿蛋白及血糖水平，并且降低蛋白尿作用可能獨立于降糖作用［3］。古方黃芪散由葛根、黃芪、桑白皮組成，以“益氣養陰”之法在治療消渴病方面獲得滿意臨床療效，但作用機制尚不清晰，本研究通過結合Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫差異基因分析及網絡藥理學，從靶基因及信號通路角度對古方黃芪散治療DN 可能作用機制進行全面探究，以期為DN的臨床治療及研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 成分篩選及靶點預測 依據TCMSP 數據庫獲取黃芪散符合生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18的活性成分，并通過PubChem 數據庫獲取對應SMILES 結構。并將結構輸入Swiss Target Prediction 及Drugbank 數據庫進行預測靶點，相似性閾值取0.85。經Uniprot 數據庫轉換基因名稱去重整合后，利用Cytoscape3.7.2軟件構建活性成分-靶點作用網絡。

1.2 差異基因分析 以“Diabetic Nephropathy”為關鍵詞檢索GEO 數據庫，確定GSE30529 包含12 個正常腎臟組織樣本，10 個DN組織樣本；GSE30528 包含13 個正常腎臟組織樣本，9個DN組織樣本。利用生物信息學之RMA算法背景校正和矩陣數據歸一化處理其原始文件，利用limma包二次分析芯片數據結合P＜0.05和差異倍數logFC絕對值＞1進行篩選，最終獲得DN的差異表達基因。

1.3 疾病基因預測 以“Diabetic Nephropathy”作為關鍵詞，采用疾病基因數據庫（DisGeNET）人類基因數據庫（GeneCards）、人類孟德爾遺傳綜合數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）以及綜合型藥物數據庫（DrugBank）對疾病靶點進行檢索，合并各數據庫及1.2中差異基因，即獲得DN相關靶點。

1.4 核心靶點查找 將黃芪散靶點與疾病靶點映射生成Venny 圖，獲得關鍵靶點，并借助String 數據庫構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡圖，根據節點連接自由度（degree）值的大小進行篩選，得到黃芪散治療DN的核心靶基因。

1.5 基因可視化 將核心靶點導入基因功能注釋數據庫（DAVID），進行京都基因與基因組大百科全書數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析以及基因本體論（gene ontology，GO）生物過程的富集分析。以P≤0.05 為篩選標準，分別將篩選出的前20 個GO 條目與KEGG條目，借助OmicShare云平臺繪制富集分析氣泡圖。

2 結 果

2.1 成分篩選及靶點預測 篩選到活性成分葛根18個、黃芪87個、桑白皮194個。根據ADME參數進一步篩選活性成分葛根4 個、黃芪20 個、桑白皮32 個，去重整合后共50 個。最后PubChem 數據庫具有SMILES 結構的活性成分15 個，見 表1。獲得預測靶 點151個，借助Cytoscape3.7.2構建活性成分-靶點作用網絡，見圖1。

圖1 黃芪散的活性成分-靶點圖

表1 黃芪散活性成分表

2.2 差異基因分析 差異基因分析顯示GSE30529 芯片有393 個基因存在表達差異，其中上調基因283 個，下調基因110 個，火山圖見圖2、熱圖見圖3；GSE30528 芯片有317個差異基因，其中上調基因82個，下調基因235個，火山圖見圖4、熱圖見圖5。

圖2 GSE30529火山圖

圖3 GSE30529熱圖

圖4 GSE30528火山圖

圖5 GSE30528熱圖

2.3 疾病基因預測 各數據庫檢索到疾病靶點DisGeNET 數據庫62 個（score≥0.3），GeneCards數據庫1 538 個（relevance≥5），OMIM 數據庫200 個以及DrugBank數據庫11 個，合并各數據庫及2.2 中差異基因，共獲得DN相關靶點2 082個。

2.4 核心靶點查找 黃芪散靶點與疾病靶點交叉生成Venny圖（圖6），通過Venny圖可以直觀發現黃芪散與DN共有55 個重合基因，表明此類靶點在治療DN 方面具有顯著特異性。將這55 個關鍵靶點導入STRING 數據庫構建PPI 相互作用網絡圖（圖7），在55 個節點在0.4 中置信度下有309 條相互作用關系，根據degree≥15 篩選到核心靶點16 個（圖8）。蛋白激酶B 1（AKT1）、表皮生長因子受體（EGFR）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、雌激素受體α（ESR1）等位于PPI 作用網絡中心位置，具有較高自由度，可能是黃芪散作用于DN的核心靶點。

圖6 黃芪散靶點與糖尿病腎病交叉生成Venny圖

圖7 關鍵靶點PPI網絡圖

圖8 核心靶點圖

2.5 基因可視化 將核心靶點導入DAVID 數據庫行基因可視化，經P≤0.05 篩選后，GO 富集出生物過程（BP）69 項，分子功能（MF）31 項，細胞成分（CC）10 項。KEGG 信號通路富集出42 條通路可能在抗DN 方面發揮有重要作用。取各項前20條以氣泡圖的形式展現出來（圖9、10）。

圖9 GO富集結果氣泡圖

3 討 論

經分析發現黃芪散與DN 之間含大量重疊靶基因，在DN 發生發展過程中具有重要地位。AKT1 具有復雜生理功能，在調控細胞周期、蛋白合成、血管構建以及胰島素依賴的細胞代謝等方面均具有重要作用。研究發現糖尿病患者腎纖維化過程中伴有AKT1的異常表達與合成，并且對高糖環境誘導的腎小管上皮細胞間充質表型轉換過程至關重要，阻斷AKT 信號分子，則能抑制此過程，改善腎纖維化［4］。相關研究發現選擇性敲除足細胞EGFR 后，會抑制高糖環境誘導的足細胞自噬，并顯著降低蛋白尿、腎小球硬化及腎臟促炎細胞因子的表達［5］。因此推測黃芪散可能通過抑制EGFR 表達，進而保護足細胞，減輕DN 患者蛋白尿。SRC 是與DN 相關的信號傳導途徑的整合者，腎小球系膜基質蛋白膠原蛋白積聚是DN的典型特征。有研究表明，SRC 激酶抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞EGFR的轉激活和膠原合成，并預防DN［6］。在DN 引起終末期腎病絕經后女性占重要比例，因此推測雌激素與DN的發病機制有關［7］。雌激素通過特異性結合ESR1 抑制血管緊張素2 及內皮素代謝合成，進而調控腎臟血管收縮，改善炎癥水平［8］。同時雌激素還能夠調控MAPK/AP-2 通路下游靶點，改善內皮細胞纖維化水平，延緩DN病理過程［9］。大量文獻研究表明，黃芪散內含大量靶基因涉及細胞自噬、炎性反應、膠原合成及雌激素代謝等多個環節，參與DN的發生發展。

圖10 KEGG信號通路氣泡圖

對核心靶點行基因GO分析發現黃芪散治療DN是通過調節一氧化氮合成酶活性、酶結合、蛋白酪氨酸激酶活性等分子功能來實現調控凋亡過程、信號轉導、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄等生物過程。KEGG 通路富集分析顯示，雌激素信號通路、Ras 相關蛋白1（Rap1）信號通路、甲狀腺激素信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路等可能是DN 發揮作用的主要特異性通路。調控雌激素信號通路在治療DN 過程中具有重要作用，流行病學顯示女性較男性而言患終末期腎病風險更高，并且腎損傷動物模型中，雌性受到的影響更少。Seppi 等研究發現絕經前婦女包括雌激素在內的生殖激素能夠促進腎小管細胞增殖、修復，抵抗腎損傷；Inada 等進一步認為雌激素能夠更加有效控制血糖水平，改善DN 帶來的腎損傷［10］。高糖環境能夠增加腎小管活性氧生成，進一步引起腎小球硬化及腎小管萎縮等糖尿病并發癥。Rap1 具有調節細胞遷移、黏附及增殖等多種生物功能，研究表明Rap1b 能夠通過調節線粒體功能來調節活性氧生成過程，改善腎小管損傷并減慢DN的進程［11］。甲狀腺激素在腎臟的生長發育過程中具有重要調控作用，甲狀腺功能障礙是DN發生的獨立危險因素，甲亢或者甲減均會激活腎素-血管緊張素系統，引起腎小球率過濾改變影響腎功能［12］。有研究表明，T3 能夠上調糖尿病小鼠模型腎臟磷脂酰肌醇3 激酶活性來減少尿白蛋白排泄、改善腎臟結構損傷，并且DN 患者的游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）水平降低，因此推測FT3 通過抑制氧化應激反應來干預DN的損傷［13］。HIF-1 通路和血管生長因子（VEGF）通路是DN 發生發展過程中重要通路，李慧等［14］研究發現尿蛋白與血清HIF-1α 和VEGF 呈負相關，并且聯系緊密，能夠加速DN發展。長期高糖環境引起腎小球微循環障礙、血流動力改變，同時紅細胞攜氧能力下降導致組織缺血缺氧。HIF-1α 作為HIF1的亞基，早期能夠使組織細胞適應缺氧環境，而DN 不斷發展時高血糖會抑制HIF-1α生成，并促使其誘導細胞凋亡，同時激活下游VEGF通路調控血管生成、增加通透性，進一步加重蛋白尿［15］。因此阻斷HIF-1及VEGF通路信號傳導具有深遠意義。

目前對DN的發病機制研究已日趨成熟，本研究通過結合GEO差異基因分析及網絡藥理學發現黃芪散通過作用于AKT1、EGFR、SRC、ESR1 等多個靶點調控雌激素通路、Rap1 通路、甲狀腺激素通路及HIF-1 通路等多條特異性通路干預DN的發生發展過程，為DN 研究及治療提供了一定理論依據。但此類信息整合研究準確性依托于新技術及各數據庫的不斷完善及發展，具體機制仍需實驗研究進一步確定。