miR-6893-5p對前列腺癌LNCaP細胞增殖和遷移的抑制作用及機制研究

王蕾 黃耿 葉志華 姜衛東 柯霓

1鄂東醫療集團黃石市中心醫院湖北理工學院附屬醫院超聲影像科 435000；2鄂東醫療集團黃石市中心醫院湖北理工學院附屬醫院泌尿外科 435000；3腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，黃石 435000

前列腺癌是最常見的男性生殖系統惡性腫瘤，手術治療和內分泌治療是前列腺癌的主要治療方式［1］。盡管前列腺癌的治療取得了較大進展，然而多數晚期前列腺癌患者的療效并不理想［2］。探究前列腺癌發生、發展的分子機制對前列腺癌的臨床診療意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是由18～25 個核苷酸組成的內源性RNA，不能翻譯為蛋白質［3］。miRNA 通過與其靶基因mRNA 特異性結合，在轉錄后水平抑制靶基因的表達，在細胞的各種生理和病理過程中發揮重要調控作用［4］。研究表明，miRNA 在包括前列腺癌在內的腫瘤中起到促癌因子或抑癌因子的作用［5］。miR-6893-5p 是一種新發現的miRNA，長度為21 個核苷酸，其在腫瘤中的表達及作用機制尚不清楚。本研究旨在探討miR-6893-5p 和前列腺癌的關系，觀察miR-6893-5p 對靶基因的調控作用及對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 RPMI 1640培養基、KSFM 培養基購自美國HyClone 公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司。正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌細胞系DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 購自上海生命科學院細胞所。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司。攜帶miR-6893-5p 序列的重組慢病毒、攜帶無意義序列的重組慢病毒、熒光素酶報告載體［S100 鈣結合蛋白A16，S100 calcium binding protein A16（S100A16）野生型及突變型］、miR-NC、miR-6893-5p購自廣州銳博生物科技有限公司。雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自美國Promega 公司。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色（MTT）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。S100A16、GAPDH、N-cadherin、CDK4 抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養和感染 將DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 細胞分別置于含10%胎牛血清RPMI 1640 培養基中，將RWPE-1 細胞置于含10%胎牛血清的KSFM 培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期的LNCaP 細胞，分別感染攜帶無意義序列的重組慢病毒（NC組）和攜帶miR-6893-5p 序列的重組慢病毒（miR-6893-5p組）。RT-qPCR檢測感染效果。

1.3 RT-qPCR 檢測細胞中miR-6893-5p 和S100A16 mRNA的表達 用TRIzol 提取上述細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，參照RT-qPCR 試劑盒說明書制備反應體系，反應參數為95 ℃2 min、95 ℃20 s、62 ℃35 s、72 ℃35 s，40 個循環。采 用2-ΔΔCt方法計算，以U6 和GAPDH 為內參計算miR-6893-5p 和S100A16 mRNA的相對表達量。RT-qPCR引物見表1。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物序列

1.4 MTT 法檢測LNCaP 細胞增殖 將兩組LNCaP 細胞以4×103個/孔接種到96 孔板，每組4 個平行孔，培養箱中培養。于接種后第1、2、3、4、5 天，加入15 μl/孔MTT 溶液，避光孵育4 h，棄去孔內液體，加入150 μl/孔DMSO，充分震蕩后酶標儀檢測460 nm 處的每孔吸光度值（A490值），繪制LNCaP細胞生長曲線。

1.5 劃痕實驗檢測LNCaP 細胞遷移 將兩組LNCaP細胞以8×105個/孔接種到6 孔板，每組4 個平行孔。細胞融合度為95%時，利用10 μl 槍頭沿6 孔板底部直線劃痕，磷酸鹽緩沖液清洗，每孔加入2 ml無血清培養基，顯微鏡下觀察測量劃痕距離L1。繼續培養24 h 后，顯微鏡下觀察測量劃痕距離L2，LNCaP細胞遷移率=（L1－L2）/L1×100%。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測 采用miRNA 靶基因預測軟件miRWalk 2.0 預測miR-6893-5p 可能調控的特異性靶基因。將重組S100A16 基因野生型及突變型熒光素酶報告基因質粒盒和miR-NC、miR-6893-5p共轉染LNCaP 細胞，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測每組細胞的熒光素酶活性。

1.7 Western blot 檢測S100A16 及NF-κB 信號通路蛋白表達 兩組LNCaP 細胞采用磷酸鹽緩沖液清洗，加入裂解液提取總蛋白。每個樣品孔加入30 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至PVDF 膜。采用5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗4 ℃下孵育過夜。加入二抗在室溫下孵育3 h，加入ECL發光試劑，曝光、顯影。

1.8 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數相比采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-6893-5p在前列腺癌細胞系中的表達 與正常前列腺上皮細胞RWPE-1 相比，前列腺癌細胞系DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 中miR-6893-5p 表達水平均明顯降低（均P＜0.05），LNCaP 細胞中miR-6893-5p的表達最低（P＜0.01），見圖1。

圖1 miR-6893-5p在正常前列腺上皮細胞與前列腺癌細胞系中的表達

2.2 慢病毒感染后LNCaP 細胞中miR-6893-5p的表達 NC組和miR-6893-5p組LNCaP 細胞中miR-6893-5p相對表達量分別為（1.07±0.21）和（9.61±1.15），差異有統計學意義（t=7.32，P＜0.01），提示攜帶miR-6893-5p 序列的慢病毒感染成功。

2.3 上調miR-6893-5p 對LNCaP 細胞增殖能力的影響 MTT 檢測結果顯示（圖2），與NC組相比，miR-6893-5p組LNCaP細胞從第2天開始，增殖能力明顯降低（P＜0.05）。

圖2 兩組重組慢病毒上調miR-6893-5p 對LNCaP細胞增殖能力的影響

2.4 上調miR-6893-5p 對LNCaP 細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結果顯示，NC組和miR-6893-5p組LNCaP 細胞遷移率分別為（72.64±5.69）%和（27.97±5.63）%，差異有統計學意義（t=5.58，P＜0.05）。與NC組相比，上調miR-6893-5p后LNCaP細胞的遷移能力被抑制。

2.5 miR-6893-5p 靶向結合S100A16 mRNA miRNA靶基因預測軟件miRWalk 2.0 預測顯示（圖3），S100A16 可能為miR-6893-5p調控的靶基因。雙熒光素酶檢測系統顯示（圖4），相比miR-NC，miR-6893-5p的相對熒光素酶活性顯著下降（t=13.10，P＜0.01），提 示miR-6893-5p 與S100A16 mRNA存在堿基互補配對。

圖3 miR-6893-5p與S100A16 mRNA的堿基互補配對位點

圖4 雙熒光素酶檢測系統驗證miR-6893-5p的靶基因

2.6 上調miR-6893-5p 對LNCaP 細胞中S100A16 mRNA 表達的影響 NC組和miR-6893-5p組LNCaP 細胞中S100A16 mRNA 相對表達量分別為（1.01±0.07）和（0.22±0.06），差異有統計學意義（t=8.77，P＜0.01）。與NC組相比，上調miR-6893-5p 可抑制LNCaP 細胞中S100A16 mRNA的表達。

2.7 上調miR-6893-5p 對S100A16 蛋白表達的影響Western blot 結果顯示（圖5），與NC組相比，上調miR-6893-5p 后，LNCaP 細胞中S100A16 蛋白表達明顯降低，細胞增殖蛋白CDK4、細胞遷移蛋白N-cadherin 表達均降低。

圖5 兩組重組慢病毒Western blot 檢測miR-6893-5p對S100A16蛋白表達的影響

3 討 論

有研究表明，miRNA在前列腺癌的發生、發展過程中發揮至關重要的作用［6］。miRNA 通過抑制靶基因的表達，表現為腫瘤抑制因子或癌基因作用，miRNA 如miR-29b-3p［7］、miR-16-5p［8］、miR-233-5p［9］等在前列腺癌組織和細胞系中高表達或低表達，與腫瘤大小、臨床分期、患者預后等密切相關。miRNA已成為前列腺癌研究領域的熱點。miR-6893-5p 是一種新發現的miRNA，其在前列腺癌細胞中的功能和作用機制并不明確。本研究結果顯示，miR-6893-5p 在前列腺癌細胞系中表達明顯下調，miR-6893-5p 可能在前列腺癌細胞中發揮腫瘤抑制因子。通過感染慢病毒構建miR-6893-5p穩定高表達的LNCaP細胞系，MTT 實驗和劃痕實驗顯示，LNCaP 細胞的增殖和遷移能力均明顯降低，進一步表明miR-6893-5p 在前列腺癌中具有抑癌作用。

為進一步研究miR-6893-5p 在前列腺癌中的作用機制，通過生物信息學和熒光素酶檢測系統發現S100A16 基因是miR-6893-5p的靶基因。S100A16 蛋白是一種小分子酸性鈣結合蛋白，屬于S100 蛋白家族［10］。S100A16 蛋白在胃癌、膀胱癌等許多腫瘤組織中表達增加，與腫瘤的發生、進展密切相關［11-12］。S100A16 蛋白在前列腺癌組織和細胞系中表達上調，抑制S100A16 蛋白表達可明顯降低前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力［13］。本研究結果顯示，上調miR-6893-5p 后，LNCaP 細胞中S100A16 表達明顯降低，進一步表明miR-6893-5p 可靶向抑制S100A16 蛋白的表達。Western blot 結果顯示，miR-6893-5p 下調S100A16 表達后，細胞增殖蛋白CDK4、細胞遷移蛋白N-cadherin 表達均降低，提示LNCaP細胞的增殖和遷移能力均被抑制。

綜上所述，miR-6893-5p 在前列腺癌細胞系中低表達，上調miR-6893-5p 可通過靶向S100A16 基因抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移，miR-6893-5p 可能成為前列腺癌潛在的治療靶點。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。