lncRNA AC051619.8通過促進CADM1表達抑制腎癌OS-RC-2細胞的增殖和遷移

柯霓 黃耿 葉志華 姜衛東 王蕾

1鄂東醫療集團黃石市中心醫院湖北理工學院附屬醫院超聲影像科 435000；2鄂東醫療集團黃石市中心醫院湖北理工學院附屬醫院泌尿外科 435000；3腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，黃石 435000

腎癌是最常見的泌尿系統腫瘤之一，源自腎實質泌尿小管上皮［1］。早期腎癌患者通常沒有癥狀，多數腎癌患者被診斷時已處于中晚期，因而腎癌患者預后較差［2］。腎癌發生和發展的機制并不完全明確，探究其分子機制有助于開發新的腎癌診斷和治療方法。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種非蛋白質編碼RNA，長度大于200 個核苷酸，廣泛參與染色質結構的修飾、基因轉錄及轉錄后水平的調控［3-4］。lncRNA 通過影響許多基因的表達，在腫瘤如腎癌的發生和發展中發揮至關重要的作用［5-6］。AC051619.8是一種新發現的lncRNA，長度為308個核苷酸，其在腎癌中的研究未見相關報道。本研究通過檢測過表達AC051619.8 對腎癌細胞增殖和遷移的影響，探討AC051619.8在腎癌發生和發展中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 RPMI 1640 培養基購自美國HyClone 公司。腎癌細胞系OS-RC-2 購自上海生命科學院細胞所。胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司。攜帶AC051619.8 序列的重組慢病毒和攜帶無意義序列的重組慢病毒購自廣州銳博生物科技有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色（MTT）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。細胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）、GAPDH、Zeb-1、CDK6 抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養和感染 OS-RC-2 腎癌細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基，培養條件為37 ℃、5%CO2。胰酶消化后制成單細胞懸液，接種在12 孔細胞板。設計分組：分別感染攜帶無意義序列的重組慢病毒（NC組）和攜帶AC051619.8 序列的重組慢病毒（AC051619.8組），48 h后收集細胞進行后續檢測。

1.3 RT-qPCR檢測AC051619.8 和CADM1 mRNA的表達 加入TRIzol 試劑裂解各組細胞，抽提總RNA 并反轉錄為cDNA，根據RT-qPCR 試劑盒說明書進行檢測，RT-qPCR 引物見表 1。以 GAPDH 為內參計算AC051619.8 和CADM1 mRNA的相對表達量，采用2-ΔΔCt方法進行計算。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物序列

1.4 MTT 法檢測OS-RC-2 細胞增殖 胰酶消化兩組OS-RC-2 細胞，計數后每孔以5×103個接種到96 孔板，每組3個平行孔。將含有MTT試劑的培養基加入每孔并培養4 h，棄去培養基，加入140 μl/孔二甲基亞砜進行溶解，酶標儀檢測每孔在460 nm 處的吸光度值（A490值）。于接種后第1、2、3、4天進行MTT法檢測，繪制OS-RC-2細胞生長曲線。

1.5 細胞劃痕實驗檢測OS-RC-2 細胞遷移 采用無血清培養基重懸兩組OS-RC-2 細胞，接種于6 孔板。當細胞融合度達到95%，使用10 μl 槍頭在6 孔板底部進行直線劃痕，加入2 ml/孔無血清培養基，在顯微鏡下記錄劃痕距離L1。培養箱培養24 h 后，在顯微鏡下記錄劃痕距離L2，OS-RC-2細胞遷移率=（L1－L2）/L1×100%。

1.7 Western blot 檢測CADM1及NF-κB 信號通路蛋白表達 采用具有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取兩組OS-RC-2細胞總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉至PVDF 膜，采用5%脫脂牛奶進行封閉。將膜分別與一抗在4 ℃下孵育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1 h，加入增強化學發光試劑，曝光、檢測蛋白條帶。

1.8 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 慢病毒感染后OS-RC-2 細胞中AC051619.8的表達 NC組和 AC051619.8組 OS-RC-2 細胞中AC051619.8 相對表達量分別為（1.03±0.13）和（9.78±1.07），兩組比較，差異有統計學意義（t=8.10，P＜0.01），提示攜帶AC051619.8序列的慢病毒感染成功。

2.2 上調AC051619.8 對OS-RC-2 細胞增殖能力的影響 MTT檢測結果顯示，與NC組相比，AC051619.8組OS-RC-2 細胞從第2 天開始，增殖能力顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組重組慢病毒上調AC051619.8對OS-RC-2細胞增殖能力的影響

2.3 上調AC051619.8 對OS-RC-2 細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，NC組和AC051619.8組OS-RC-2細胞遷移率分別為（58.68±4.01）%和（25.22±5.38）%，差異有統計學意義（t=4.99，P＜0.01）。與NC組相比，上調AC051619.8后OS-RC-2細胞的遷移被抑制。

2.4 上調AC051619.8 對OS-RC-2 細胞中CADM1 mRNA 表達的影響 NC組和AC051619.8組OS-RC-2 細胞中CADM1 mRNA 相對表達量分別為（1.05±0.18）和（5.71±0.47），差異有統計學意義（t=9.22，P＜0.01）。與NC組相比，上調AC051619.8 可促進OS-RC-2 細胞中CADM1 mRNA的表達。

2.5 上調AC051619.8 對CADM1 蛋白表達的影響Western blot 結果顯示（圖2），與NC組相比，上調AC051619.8 后，OS-RC-2 細胞中CADM1 蛋白表達明顯增加，細胞增殖蛋白CDK6 表達降低，細胞遷移蛋白Zeb-1 表達降低。

圖2 兩組重組慢病毒Western blot 檢測AC051619.8 對CADM1蛋白表達的影響

3 討 論

近年來，lncRNA 在腎癌中的作用已有很多報道［7］。lncRNA 如 PCGEM1［8］、NORAD［9］、MIR4435-2HG［10］、FGD5-AS1［11］等在腎癌組織和細胞系中異常表達，與腫瘤患者的臨床分期、分級、預后顯著相關。lncRNA 已成為腎癌研究領域的熱點。AC051619.8 是一種新發現的lncRNA，其在腎癌中的作用和分子機制并不明確。本研究通過感染慢病毒構建AC051619.8穩定高表達的OS-RC-2細胞系，過表達AC051619.8 后的OS-RC-2 細胞增殖和遷移能力均顯著降低，提示AC051619.8可能是腎癌的抑癌lncRNA。

CADM1 蛋白包含442 個氨基酸，屬于細胞黏附分子免疫球蛋白家族成員，CADM1 可通過非依賴鈣鎂離子途徑影響細胞間黏附及信號轉導［12］。CADM1 蛋白在結腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤組織均呈低表達，上調CADM1 可明顯抑制腫瘤細胞的生長和轉移，CADM1 發揮明顯的腫瘤抑制因子作用［13-14］。本研究結果顯示，上調AC051619.8 后，OS-RC-2 細胞中 CADM1 表達明顯增加，表明AC051619.8 可促進CADM1 蛋白表達。Western blot 結果顯示，AC051619.8 上調CADM1 表達后，細胞增殖蛋白CDK6 表達降低，細胞遷移蛋白Zeb-1 表達降低，提示OS-RC-2細胞的增殖和遷移能力均明顯降低。

綜上所述，過表達AC051619.8 能抑制腎癌細胞的增殖和遷移，AC051619.8 可能是腎癌的抑癌lncRNA，CADM1 可能是AC051619.8的作用靶點。AC051619.8 研究為進一步理解腎癌的發病機制提供了參考。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。