mpt64 mRNA作為結核化療細菌學監控的分子標志物研究

雷杰 王楠 牛群 謝貝 吳玲 鄧麗 劉志輝 孟繁榮

廣州市胸科醫院肺部疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室 510095

結核病作為一類慢性傳染性疾病，主要是由結核桿菌感染，在全球范圍內流行，嚴重危害人類健康。化學療法［1］是治愈結核病和限制結核桿菌傳播的重要手段，找到一種能夠快速反映結核病化療療效的生物標志物，實現對化療療效效果的監控與評價顯得十分重要。近些年來，隨著現代醫學技術的快速發展，各種新型標志物不斷被發現，它們的高敏感性、高特異性和快速性給結核病的化療監控帶來新的期望，然而這些標志物大都不能滿足臨床上對結核病化療監控的全部要求。mpt64 是結核桿菌在生長早期大量分泌的特異性蛋白，可分泌至菌體外。mpt64 mRNA產生于結核桿菌合成mpt64分泌蛋白時，由結核桿菌內的mpt64基因編碼并生成，屬于活菌體中極為重要的一個組成部分，同時mpt64 mRNA 有較短的半衰期，一般僅為數分鐘。由此可見，mpt64 mRNA作為一種監控結核病化療療效的細菌學分子標志物將大有可為。本研究探討mpt64 mRNA 作為結核化療細菌學監控的分子標志物可行性。

1 資料與方法

1.1 菌株 2021 年1 月至4 月，于廣州市胸科醫院分枝桿菌菌種庫中，隨機選取35 株對4 種一線抗結核藥物敏感的臨床分離株。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10 培養基購自美國BD 公司，異煙肼購于瑞威爾生物科技有限公司，細菌總RNA 快速抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，反轉錄反應試劑盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit）購自美國賽默飛世爾公司，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測試劑盒（TB Green Fast qPCR Mix）購自北京寶日醫生物技術有限公司。PCR 擴增儀（C1000TM Thermol cycle 系列）購自美國BIO RAD 公司，熒光定量PCR 擴增儀（Viia 7 DX）購自美國ABI公司。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 結核分枝桿菌培養及藥物處理結核分枝桿菌經復蘇培養后選取Middlebrook 7H10 培養基上處于對數期生長旺盛狀態良好的菌株，制成濁度為1 麥氏的菌懸液，取100.0 μl 菌液接種至10 ml 新鮮Middlebrook 7H9 培養基，加入異煙肼藥液使培養基中藥物終濃度分別為0、0.2、0.5 μg/ml，37 ℃培養48 h后收集菌液3 ml，13 000 g離心10 min，菌體-70 ℃保存備用。

1.2.2.2 總RNA 提取純化及反轉錄為保證RNA 提取效率一致，不同藥物濃度處理的標本同時提取RNA。所用容器耗材均經0.1%DEPC 水浸泡24 h，121 ℃高壓30 min處理，所有提取過程置于冰浴操作，提取過程遵照RNA 提取試劑盒說明書執行，獲得的總RNA溶于20.0 μl DEPC水中。取10.0 μl 上述總RNA，加入2.0 μl 10×RT Buffer，0.8 μl 25×dNTP Mix（100 mM），2.0 μl 10X RT Random Primers，1.0 μl MultiScribe ?Reverse Transcriptase，1.0 μl RNase Inhibitor，3.2 μl DEPC 水配制成20.0 μl 反應體系，置于PCR 儀中，反應條件：25 ℃10min，37 ℃120 min，85 ℃5 min。

1.2.2.3 實時熒光定量PCRPCR 引物序列：正向5’GGTGATTGGCTTGCGATAGG3’，反向5’TGAATATCACCTCGGCCACA 3’，擴增片段長度152 bp，由北京六合華大基因科技有限公司生物合成。反應體系20.0 μl，包括TB Green Fast qPCR Mix 10.0 μl、正反向引物各0.8 μl、Rox Reference Dye 0.3 μl、cDNA模板1.0 μl以及滅菌水7.1 μl。反應條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃15 s，40 個循環并設立溶解曲線階段，每次反應設陰性、陽性對照。結果判讀：擴增結束后，檢查溶解曲線為單一峰，設定基線范圍6.00～10.00，基線值0.01，判斷擴增曲線呈S 形，讀出cDNA的Ct值。

1.3 統計學分析 采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。數據經正態性檢驗，符合正態性分布，采用平均值、標準差等進行描述性統計。獨立樣本t檢驗比較不同處理組間的差異性。檢驗水準=0.05，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結 果

所有樣本熒光定量PCR 檢測均出現了典型的擴增曲線，無藥處理組（C）mpt64 mRNA Ct 值為（25.34±2.56），0.2 μg/ml 異煙肼處理組（T1）mpt64 mRNA Ct 值為（29.09±3.25），0.5 μg/ml 異煙肼處理組（T2）mpt64 mRNA Ct 值為（30.14±3.23）。相較于無藥對照組，0.2 μg/ml異煙肼處理組mpt64 mRNA 增加（3.75±2.68）個Ct 值，0.5 μg/ml 異煙肼處理組增加（4.80±2.33）個Ct 值，mpt64 mRNA 表達水平降低，與無藥對照組比較差異均有統計學意義（t=-5.37、-6.89，均P＜0.01）。0.2、0.5 μg/ml 兩個處理組間差異無統計學意義（t=-1.36，P=0.18）。具體見表1、圖1。

表1 35株對一線抗結核藥物敏感的臨床分離株不同處理組mpt64 mRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應擴增Ct值

圖1 35株對一線抗結核藥物敏感的臨床分離株不同處理組mpt64 mRNA實時熒光定量PCR擴增Ct平均值柱形圖

3 討 論

眾所周知，臨床上治療結核病的方法是直接抗菌療法［2］，評價化療療效通常采用和診斷結核病相同的常規技術方法，包括細菌學、影像學、免疫學和分子生物學等方法［3-4］，各自方法具有不同的實際價值。痰涂片抗酸桿菌鏡檢和結核分枝桿菌分離培養操作簡便，設備費用要求低，是我國目前普及最廣的方法，但痰涂片抗酸桿菌鏡檢并不能區分出死活菌，傳統的改良羅氏培養法需要4～8 周時間，不能滿足臨床需要。胸部影像學檢查（X 線胸片、CT 片）是發現和診斷肺結核的重要方法之一，能準確了解肺部病變部位的動態變化，尤其是對菌陰性肺結核［5-6］具有較高的敏感性，但肺部各種疾病的病變在胸部影像學檢查上特異性較差，容易造成定性困難。

近些年來，隨著免疫學技術與分子生物學的發展，各類分子標志物層出不窮，它們的高敏感度、高特異度和快速性給結核病的化療監控帶來新的期望。張雪等［7］、Tonby K等［8］的研究表明，血清干擾素誘導蛋白10（IP-10）可作為臨床早期診斷活動性肺結核的檢測指標，但Amanatidou V等［9］的研究表明，體內IP-10水平可能存在一定的年齡依賴性，兒童體液免疫功能跟成人不同，IP-10 在兒童結核診斷中仍存在很多問題。

目前臨床上使用最廣泛的熒光定量PCR 檢測試劑盒大多數都是以IS6110 作為靶序列設計的，IS6110 作為結核桿菌DNA 基因組中一個多拷貝的保守片段，PCR 方法檢測敏感度與特異度較好。但也有研究顯示，PCR 方法檢測易受如實驗條件的設置、引物的設計、標本的類型不同和處理方法不同等多方面因素的影響，且有些菌株中缺乏IS6110，易造成假陰性結果。另外，結核分枝桿菌DNA 分子穩定，半衰期長，平臺效應強，TB-DNA 不能區分活動性結核和潛伏性結核。

結核桿菌RNA 分子半衰期短，僅存在于活動性的菌體中，檢測RNA 水平的變化用于結核病化療療效的監測［10-11］有著天然的優勢。目前臨床上使用最廣泛的恒溫擴增實時熒光檢測技術（SAT）就是檢測結核桿菌菌內核糖體RNA（rRNA），但研究表明，rRNA 分子穩定，具有平臺效應且半衰期遠大于mRNA。85B mRNA 編碼結核桿菌85B 蛋白，特異性強［12］，活菌細胞含量豐富，但相關研究顯示，由于藥物靶位效率不同，利福平對85B mRNA的表達量有著明顯的抑制作用，產生出多藥方案中利福平掩蓋其他藥物的預示作用。因此，上述標志物用于評價結核病化療療效監控均不理想。mpt64 mRNA 產生于結核桿菌合成mpt64 分泌蛋白時，由結核桿菌內的mpt64 基因編碼并生成，屬于活菌體中極為重要的一個組成部分，同時mpt64 mRNA 有較短的半衰期，其更新時間一般僅為數分鐘。另外mpt64 蛋白只會存在于具有致病性的結核桿菌中，具有特異性。因此，有望通過監測mpt64 mRNA的變化，監測結核桿菌濃度的變化。

本研究結果顯示，相對于無藥處理組，異煙肼處理組結核桿菌mpt64 mRNA表達水平均低于無藥處理組，0.2 μg/ml異煙肼處理組mpt64 mRNA 增加（3.75±2.68）個Ct 值，0.5 μg/ml 異煙肼處理組增加（4.80±2.33）個Ct 值，與無藥處理組相比，差異均有統計學意義（均P＜0.05），說明在短時間內，異煙肼可以抑制結核桿菌mpt64 mRNA的表達，mpt64 mRNA的分子表達水平與結核桿菌的活動情況有關；兩個處理組間差異無統計學意義（P＞0.05），說明結核桿菌mpt64 mRNA的表達水平與異煙肼藥物濃度無關。

值得注意的是，有研究顯示，mpt64 蛋白在部分結核桿菌中存在不表達的情況，導致假陰性的產生，其原因主要是mpt64 mRNA基因發生整體缺失和突變的情況，直接造成結核菌無法正常合成mpt64 mRNA［13］。本研究在引物的設計過程中，選擇了比較保守的基因片段，對mpt64 mRNA的擴增均避開了易突變位點，不存在檢測不到的情況，有效保障了檢測結果的準確性與可靠性。

綜上，mpt64 mRNA表達水平可在短時間內反映出藥物對結核桿菌的作用效果，有望成為結核病化療療效監測的分子標志物，作為結核病化療療效評價的一個重要細菌學監控工具。本研究的不足之處是，未對結核桿菌藥物敏感株進行更長時間的培養，缺少更長時間下mpt64 mRNA 變化情況的監測，在后續工作中會繼續加強研究，如周期更長的臨床標本驗證以及與培養法檢測結果的對比分析等，提供更為全面的數據支持。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。