雷公藤大環多胺類生物堿的質譜裂解規律及其快速識別研究

劉莉 蔣紅霞 孫群 陳殊 劉建群

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）16-1944-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.05

摘 要 目的：研究雷公藤大環多胺類生物堿的質譜裂解規律，建立快速識別該類生物堿的方法。方法：在色譜柱為Hypersil GOLDTM C18、流動相為0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）（梯度洗脫）、流速為0.25 mL/min、柱溫為40 ℃、進樣量為2 μL的色譜條件下，以及在離子源為電噴霧離子源、掃描模式為正離子模式、裂解電壓為100 V、碰撞能量為35 eV、掃描范圍為m/z 100～2 000的質譜條件下，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜技術（UPLC-Q-TOF-MS/MS）結合PeakView 1.2軟件分析celafurine、celabenzine、celacarfurine和celacinnine等4個大環多胺生物堿對照品和雷公藤總提取物的質譜信息，并總結該類生物堿的質譜裂解規律。根據保留時間、精確分子量及二級質譜碎片離子信息，參照上述質譜裂解規律，對雷公藤總提取物中大環多胺生物堿成分進行快速識別，并通過查閱Scifinder數據庫及文獻比對判斷其是否為新化合物。結果：在正離子掃描模式下，m/z 160.11（基峰）、m/z 188.10和m/z 100.07為大環多胺生物堿的二級質譜特征裂解碎片離子。根據精確分子量和質譜裂解規律從雷公藤總提取物中快速識別大環多胺生物堿10個，其中化合物1～6、8分別為2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-acetyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-nicotinoyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine，其余3個化合物結構待定。化合物3、7、9和10可能為新的化合物。結論：大環多胺生物堿能夠形成m/z 160.11（基峰）、m/z 188.10和m/z 100.07等3個共同特征碎片離子，可用于該類活性成分的快速識別。

關鍵詞 雷公藤;大環多胺生物堿;質譜裂解規律;快速識別

Study on the Mass Spectrometry Fragmentation Regularity and Rapid Identification of Macrocyclic Polyamine Alkaloids from Tripterygium wilfordii

LIU Li，JIANG Hongxia，SUN Qun，CHEN Shu，LIU Jianqun（Key Laboratory of Modern TCM Preparation of Ministry of Education， Jiangxi University of TCM， Nanchang 330004， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mass spectrometry fragmentation regularity and establish rapid identification method of macrocyclic polyamine alkaloids from Tripterygium wilfordii. METHODS： The determination was performed on Hypersil GOLDTM C18 column with 0.1% formic acid solution （A）-methanol （B） as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was 40 ℃， and sample size was 2 μL. The mass spectrometric condition included ESI， positive ion mode， breakdown voltage of 100 V， collision energy of 35 eV， and scanning range of m/z 100-2 000. UPLC-Q-TOF-MS/MS combined with PeakView 1.2 software were used to analyze mass spectrum of 4 macrocyclic polyamine alkaloids control as celafurine， celabenzine， celacarfurin， celacinnine and total extract of T. wilfordii， and summarized the mass fragmentation regularity of alkaloids. According to retention time， accurate molecular weight and secondary mass fragment ion information， referring to the above mass spectrometry fragmentation regularity， macrocyclic polyamine alkaloids in the total extract of T. wilfordii were quickly identified， and whether it was a new compound was determined by consulting Scifinder database and literature comparison. RESULTS： There were three characteristic cleavage fragments of macrocyclic polyamine alkaloids， i.e. m/z 160.11 （base peak）， m/z 188.10 and m/z 100.07 in positive ion mode. According to the precise molecular weight and mass spectrometry fragmentation regularity， 10 macrocyclic polyamine alkaloids were identified rapidly， and compound 1-6， 8 were 2-phenyl-1， 5， 9-triazacy- clotridecan-4-one， 9-acetyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one， 9-nicotinoyl-2-phenyl-1， 5， 9-triazacyclotridecan-4-one， celafurine， celabenzine， celacarfurine， celacinnine， respectively. Compounds 3， 7， 9 and 10 might be new compounds. CONCLUSIONS： The macrocyclic polyamine alkaloids can form three common characteristic fragment ions， m/z 160.11 （base peak）， m/z 188.10 and m/z 100.07， which can be used for the rapid identification of these active components.

KEYWORDS? ?Tripterygium wilfordii; Macrocyclic polya- mine alkaloids; Mass spectrometry fragmentation regularity; Rapid identification

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.為衛矛科雷公藤屬植物，藥用部位為根，首載于《神農本草經》，主產于我國長江中下游流域（如浙江、福建、江西、安徽等地）[1]。雷公藤味苦，性寒，有大毒，歸肝、腎二經，具有清熱解毒、祛風通絡、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲、止血等功效[2]。雷公藤在臨床上常用于治療類風濕性關節炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡等難治性免疫功能亢進疾病，是治療風濕頑痹之要藥[3]。生物堿類成分包括倍半萜生物堿和大環多胺生物堿兩類，是雷公藤的主要有效成分之一，具有免疫抑制、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、抗艾滋病、保護神經等多種藥理活性[1]。其中，大環多胺生物堿具有13元大環母核，大環上一般含有3個氮原子，結構較為獨特[1]。目前報道的天然大環多胺生物堿雖然較少，但其具有抗寄生蟲、抗質粒DNA斷裂、抗腫瘤和抗炎等多種藥理作用[4-5]，藥用研究前景較廣闊。

本課題組前期從雷公藤中分離、鑒定出了4個大環多胺生物堿，分別為celafurine、celabenzine、celacarfurine和celacinnine（結構式見圖1）[5]。超高效液相色譜與高分辨質譜聯用技術已成為復雜中藥化學成分快速表征的主要技術。通過研究已知中藥化合物的多級質譜裂解規律，總結其特征碎片，從而建立中藥化合物快速鑒定和復雜體系成分表征的質譜方法已成為中藥復雜體系化學成分快速識別研究的熱點[6-8]。鑒于此，本課題組擬在前期研究基礎上，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜技術（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對雷公藤中celafurine、celabenzine、celacarfurine和celacinnine等4個大環多胺生物堿的質譜裂解規律進行研究，以期為該類生物堿的快速識別提供新方法。

1 材料

1.1 主要儀器

LC-30A型高效液相色譜（HPLC）儀購自日本Shimadzu公司;AB Sciex Triple TOF 5600型質譜儀購自美國AB Sciex公司;N-1300型旋轉蒸發儀購自日本EYELA公司;GZX-9140 MB型數顯鼓風干燥箱購自上海博訊實業有限公司;BT25S型十萬分之一電子天平購自德國Sartorius公司;Milli-Q型超純水制備儀購自美國Millipore公司。

1.2 主要藥品與試劑

雷公藤藥材于2020年7月采自江西省萍鄉市，經江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室劉建群教授鑒定為衛矛科雷公藤屬植物雷公藤T. wilfordii Hook. f.的根;celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine對照品由本實驗室從雷公藤藥材中分離制得，經核磁共振（NMR）、UPLC-Q-TOF-MS/MS等技術鑒定，其結構與文獻[5，9-10]一致，經HPLC峰面積歸一化法測得其純度均大于99%;甲酸（批號J1815074，質譜純）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇（批號06C1612FK，質譜純）購自美國ACS公司;乙醇（批號18092202，分析純）購自西隴科學股份有限公司;水為超純水。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 雷公藤總提取物溶液 稱取雷公藤藥材3.8 g，粉碎后過一號篩，加入95%乙醇50 mL，于70 ℃加熱回流提取3次（時間分別為1.5、1.5、1 h），合并3次提取液，減壓濃縮至2 mL。取濃縮液200 μL，加入甲醇400 μL，混勻，過0.22 μm有機濾膜，收集濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液 稱取celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine對照品各適量，分別用甲醇溶解，制成質量濃度均為0.5 mg/mL的溶液，即得。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS測定條件

2.2.1 色譜條件 以Hypersil GOLDTM C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動相進行梯度洗脫（0.01～20 min，10%B→32%B;20～45 min，32%B→90%B;45～47 min，90%B;47～47.1 min，90%B→10%B;47.1～50 min，10%B）;流速為0.25 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為2 μL。

2.2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源，掃描模式為正離子模式;噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度500 ℃;裂解電壓為100 V;碰撞能量為35 eV，碰撞能量擴展為15 eV;霧化氣為N2，霧化氣壓力為50 psi;輔助氣1（GS1）壓力為50 psi，輔助氣2壓力（GS2）為50 psi;氣簾氣（CUR）壓力為40 psi;母離子掃描范圍為m/z 100～2 000。

2.3 樣品測定及分析

取“2.1”項下雷公藤總提取物溶液和對照品溶液各2 μL，分別按“2.2”項下條件進樣測定，記錄圖譜。采用PeakView 1.2軟件分析各對照品和雷公藤總提取物的質譜信息，并總結4個大環多胺生物堿對照品的裂解規律。根據保留時間、精確分子量及二級碎片離子信息，參照大環多胺生物堿對照品的質譜裂解規律，對雷公藤總提取物中的大環多胺生物堿成分進行快速識別，并通過查閱Scifinder數據庫判斷其是否為新化合物。

3 結果

3.1 4個大環多胺生物堿對照品的質譜裂解規律

celafurine、celabenzine、celacinnine的二級質譜（MS/MS）中有m/z 160.11、m/z 188.10和m/z 100.07這3個共同的離子碎片，其中m/z 160.11為基峰，m/z 188.10和m/z 100.07信號較弱;而celacarfurine的MS/MS中同樣有m/z 188.10離子碎片，但缺少m/z 160.11、m/z 100.07這2個離子碎片，筆者推測這可能與celacarfurine的13元環上多了1個羰基有關。大環多胺為13元大環，環張力非常小，其化學性質與鏈狀化合物相似。因此，筆者推測其質譜裂解過程可能是首先斷裂大環上的某個弱鍵（如C—N），開環，形成相同分子量的開鏈雙鍵化合物同分異構體，然后斷裂開鏈雙鍵化合物上的另外某些弱鍵（如C—N），進一步發生中性分子丟失，最終形成共軛度較大的穩定裂解碎片。4個大環多胺生物堿對照品的MS/MS圖見圖2，celafurine、celabenzine、celacinnine的共同MS/MS特征碎片的可能裂解途徑見圖3。

3.2 雷公藤總提取物中大環多胺生物堿的快速識別

3.2.1 大環多胺類生物堿質譜信息分析及快速識別 為從雷公藤中快速識別大環多胺生物堿類成分，本研究對雷公藤總提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS圖譜進行m/z 160.11和m/z 188.10特征離子提取，并根據精確分子量以及MS/MS特征裂解碎片，快速識別了10個大環多胺生物堿，并推斷其中化合物1～6、8分別為2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-acetyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-nicotinoyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine，其余3個結構待定。經查詢Scifinder數據庫，化合物3、7、9和10可能為新化合物。雷公藤總提取物的總離子流圖見圖4，10個化合物的基本信息見表1，對應結構式（化合物4～6、8除外）見圖5。

3.2.2 代表性大環多胺生物堿結構解析及其可能的MS/MS裂解過程推斷 以化合物3為例，對其結構解析以及MS/MS裂解過程進行說明。首先，根據MS精確分子量m/z 381.228 1[M+H]+確定化合物3的分子式可能為C22H28N4O2;隨后，除去13元環母核分子式得N-9位取代基的分子式為C6H4NO，初步推斷9位取代基為煙酸酰基。MS/MS裂解過程如下：首先斷裂大環上的某個弱鍵（如C—N），開環，形成相同分子量的開鏈雙鍵化合物同分異構體，然后斷裂開鏈雙鍵化合物上的另外某些弱鍵（如C—N），進一步發生中性分子丟失，最終形成特征裂解碎片m/z 160.112 0（基峰）、m/z 188.106 5（信號較強）和m/z 100.076 1（信號較弱）。隨后，丟失中性分子氨氣形成m/z 364.203 1的碎片離子，再丟失苯乙胺形成m/z 260.138 7的碎片離子，與上述初步推斷的分子結構相吻合。經查詢Scifinder數據庫，發現化合物3為新化合物。化合物3可能的MS/MS裂解途徑見圖6。

3.3 大環多胺生物堿可能的生物合成途徑

探索天然活性成分的生物合成途徑并據此設計仿生合成路線，對創新藥物的研究具有重要的參考價值。生物堿為生物體的次生代謝產物，其是初級代謝產物氨基酸通過生物合成途徑所生成的。有研究指出，形成生物堿的氨基酸大多是α-氨基酸（如賴氨酸、鳥氨酸和苯丙氨酸等），這些氨基酸的骨架大部分保留在所產生的生物堿中[12]。參考相關文獻，筆者推測大環多胺生物堿（除化合物6）可能經過谷氨酸→鳥氨酸→腐胺→亞精胺等生物合成途徑形成[13-14]，具體生物合成途徑見圖7。一般而言，大環多胺生物堿13元環上只有1個羰基，而化合物6為首次報道的13元環上具有2個羰基的大環多胺生物堿，其生物合成途徑有待進一步研究。

4 討論

由質譜分析可見，在正離子模式下，同類型的大環多胺生物堿celafurine、celabenzine和celacinnine的質譜裂解途徑基本一致，都形成了m/z 160.11（基峰）、m/z 188.10和m/z 100.07等共同的碎片離子。而大環上多含有1個羰基的大環多胺生物堿celacarfurine同樣有m/z 188.10的碎片離子，但缺少了m/z 160.11、m/z 100.07這2個碎片離子。大環多胺為13元大環，環張力非常小，其化學性質與鏈狀化合物相似。這3個特征離子可能是通過如下過程形成的：首先大環開環，斷開某一弱鍵（如C—N），形成鏈狀正離子，再斷開另一弱鍵（如C—N），發生中性分子丟失，形成共軛程度較大的穩定正離子。從大環多胺生物堿結構來看，其一般具有共同的13元環母核（celacarfurine較特殊，大環上多含有一個羰基[5]，區別在于9位取代基不同），其結構上的共同點正是能夠形成m/z 160.11、m/z 188.10和m/z 100.07這3個共同特征碎片離子的原因。因此，這些特征離子可作為判斷大環多胺生物堿類成分結構的重要依據。

目前，celacarfurine型13元大環多胺生物堿僅見本課題組報道[5]，其質譜裂解規律還有待進一步研究。根據MS精確分子量以及MS/MS特征碎片，筆者從雷公藤總提取物中快速識別了10個大環多胺生物堿類化合物，其中4個可能為新的化合物，這也體現了液質聯用技術在中藥復雜體系化學成分快速識別方面具有顯著優勢。

綜上，本研究豐富了大環多胺生物堿的質譜信息及裂解規律，初步建立了該類成分的快速識別方法，為雷公藤等中藥中該類活性成分的分離鑒定指明了方向，同時也為大環多胺類生物堿的進一步研發應用奠定了基礎。

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（收稿日期：2021-02-25 修回日期：2021-06-24）

（編輯：林 靜）