丹酚酸B調節Bax/Bcl-2的表達對阿爾茨海默病小鼠認知功能的影響及機制

張 瑞，延沁儒

（1.西安國際醫學中心醫院神經康復科，陜西 西安 710000；2.空軍軍醫大學第二附屬醫院康復理療科，陜西 西安 710000）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種進行性神經功能障礙疾病，主要損害運動、記憶、言語和認知[1]。該病特征是在杏仁核、海馬、大腦皮層和基底節中發現的膽堿能神經元變性，導致神經遞質乙酰膽堿的合成和分泌減少及β 淀粉樣蛋白（beta amyloid peptides，Aβ）沉積聚集。其中Aβ 誘導炎癥反應、線粒體功能障礙和細胞凋亡可能在毒性循環中相互作用并相互擴增，阻斷海馬突觸可塑性導致腦中神經細胞逐漸死亡，引發記憶障礙[2]。據報道，AD與氧化應激（oxidative stress，OS）密切相關，線粒體尤其是電子傳輸鏈復合物Ⅰ和Ⅲ是產生和積累活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要位點，氧化損傷神經元線粒體的直接結果是細胞凋亡，與AD 患者中神經元凋亡一致[3]。目前常用于治療AD的5 種藥物只能通過改善癥狀最大限度的提高患者生活質量[1]。AD 致病機制復雜、缺乏早期診斷和有效治療藥物等，給家庭和社會帶來了沉重的經濟和心理負擔。因此，AD的防治仍是醫學所面臨的挑戰之一。丹參是一種傳統中草藥，常用于治療心腦血管相關疾病。丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是從丹參中提取的含量最豐富和活性最高水溶性成分[4]。近年來，研究表明Sal B 具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纖維化、調節自噬等作用，并且可以促進干細胞的增殖和分化，促進腦血管生成，改善腦微循環，對心腦血管疾病具有保護作用[4-6]，但臨床上有關Sal B 對AD的治療及作用機制還甚少報道。本實驗通過觀察Sal B 對AD小鼠模型認知功能的影響，探究Sal B 對其凋亡的作用及機制，旨在為AD的治療提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 選擇6 月齡SPF 級昆明小鼠40 只，體重（40±3）g，購于廣州醫學動物實驗中心（SCXK 粵2013-0002），Sal B 購于成都普菲德生物科技有限公司，D-半乳糖購于Sigma 公司，氯化鋁（AlCl3）購于廣州化學試劑場，STT-2 小鼠跳臺儀購于北京科學院研究所，氧化指標試劑盒購于南京建成公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cysteine-containing aspartate-specific protease-3，Caspase-3）抗體購于英國CST 公司，B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）抗體購于博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構建與分組干預 實驗動物給予飼料和超純水自由喂養，保持室溫20 ℃～25 ℃、濕度55%～65%，適應性喂養1 周之后，按體重大小給動物編號，隨后利用隨機數字表連續獲得40 個數字，除以組數求余數，余數1、2、3、4 分別將動物納入：對照組，AD 模型組，Sal B 低劑量組（salvianolic acid B low dose group，Sal B-L）和Sal B 高劑量組（salvianolic acid B high dose group，Sal B-H）；每組多于10 只的小鼠繼續以上操作，按新余數納入組別，直至每組10 只。AD 模型組給予腹腔注射濃度為120 mg/（kg·d）體積0.2 ml D-半乳糖；灌胃濃度10 mg/（kg·d）體積0.1 ml AlCl3；腹腔注射0.1 ml 生理鹽水，連續8周。Sal B 組給予腹腔注射濃度120.0 mg（kg·d）體積0.2 ml D-半乳糖，灌胃濃度10 mg（kg·d），體積0.1 ml AlCl3，此基礎上Sal B-L 組給予腹腔注射濃度30mg（kg·d）體積0.1 ml Sal B；Sal B-H 組給予腹腔注射濃度60 mg/（kg·d）體積0.1 ml Sal B。對照組給予等體積生理鹽水。

1.2.2 跳臺實驗 最后1 次給藥后第2 天開始跳臺實驗。STT-2 型小鼠跳臺儀，通電0.2 mA。先讓小鼠在跳臺儀內適應5.0 min，隨后給跳臺儀通電。當其遭受電擊，正常反應為避開電擊跳上絕緣臺。小鼠5.0 min內從絕緣臺跳下次數，記做學習成績。第2 天相同時間重復實驗，其5.0 min 內第1 次從絕緣臺跳下時間，記做潛伏期。同時記錄小鼠5.0 min 內跳下絕緣臺總次數，即錯誤次數。

1.2.3 取材和處理 跳臺實驗結束24 h 后稱重小鼠，并在10%水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射徹底麻醉小鼠后摘眼球取血，儲存至抗凝EP 管。于4 ℃冰箱靜置血液4 h 后離心（3500 r/min，10 min），取上清備用。用于檢測GSH-PX、SOD 及MDA 含量。采用頸椎離斷法處理小鼠，提取腦組織。在冰凍臺上沿小鼠大腦組織的矢狀位將大腦均分為兩半，提取海馬。存放于-80 ℃冰箱，用于檢測Western Bolt 目的蛋白及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.2.4 氧化應激指標檢測 血清樣品：取生理鹽水稀釋的血清做正式實驗。大腦組織樣品：將海馬組織加入生理鹽水置于勻漿器，于冰上手動勻漿1 h。隨后4 ℃離心（12000 r/min，5 min），提取上清。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，測定樣品中SOD 活性，MDA 及GSH-PX 含量。

1.2.5 Western Blot 檢測細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達 冰上裂解海馬組織，提取蛋白。BCA法蛋白定量，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱導致蛋白變性，選取20 μg 上樣量，電泳、電轉，孵育Caspase-3、Bcl-2、Bax 抗體，4 ℃過夜；次日二抗孵育，顯色，凝膠成像分析系統曝光，測定光密度。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS 19.0 軟件分析，先進行正態性檢驗，服從正態分布的數據以（）表示，采取單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P≤0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠認知功能變化比較 與對照組比較，AD 組潛伏期降低、訓練錯誤和記憶錯誤次數增加（P＜0.05）；與AD 模型組比較，Sal B 各組潛伏期延長、訓練和記憶錯誤次數減少（P＜0.05）；與Sal B-L組比較，Sal B-H 組潛伏期延長（P＜0.05）、訓練錯誤和記憶錯誤次數未見明顯差異（P＞0.05），見圖1、表1。

表1 小鼠跳臺實驗結果（n=10，）

表1 小鼠跳臺實驗結果（n=10，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較，#P＜0.05；與Sal B-L 組比較，▽P＜0.05

圖1 小鼠跳臺實驗結果

2.2 各組小鼠SOD、GSH-PX 活性及MDA 含量比較與對照組比較，AD 模型組小鼠腦組織及血清中GSH-PX、SOD 活性減弱，MDA 含量上升（P＜0.05）；與AD 模型組相較，Sal B 各組小鼠腦組織及血清中GSH-PX、SOD 活性增強，MDA 含量降低（P＜0.05）；與Sal B-L 組比較，Sal B-H 組腦組織及血清中GSH-PX、SOD 活性增強，MDA 含量降低（P＜0.05），見圖2、表2、表3。

表2 小鼠血清MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

表2 小鼠血清MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較，#P＜0.05；與Sal B-L 組比較，▽P＜0.05

表3 小鼠腦組織MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

表3 小鼠腦組織MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

注:與對照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較#P＜0.05；與Sal B-L 組比較，▽P＜0.05

圖2 小鼠氧化指標

2.3 各組小鼠Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達比較與對照組比較，AD 模型組小鼠海馬中Bax/Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達增高（P＜0.05）；與AD 模型組比較，Sal B 各組小鼠海馬Bax/Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達降低（P＜0.05）；Sal B-H 組Bax/Bcl-2 以及Caspase-3 蛋白表達與Sal B-L 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表4。

表4 小鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達（n=10，）

表4 小鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達（n=10，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較，#P＜0.05

圖3 小鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達情況

3 討論

D-半乳糖堆積在細胞內，經醛糖還原酶及半乳糖合成酶作用，導致細胞腫脹、線粒體空泡樣變性、功能障礙，最終引起衰老[7]；而鋁易透過血腦屏障，降低抗氧化酶水平、改變鈣穩態、升高代謝性谷氨酸受體表達等，破壞突觸可塑性、誘導神經元凋亡從而損害學習記憶水平[8]。本實驗采用長期高濃度氯化鋁灌胃聯合腹腔注射D-半乳糖建立復合AD 小鼠模型[9]，結果顯示相較于正常對照組，AD 模型組小鼠出現脊柱前凸、脫毛、活動遲緩；行為學實驗結果提示，AD 模型組小鼠發生學習記憶障礙。此模型取得的實驗結果具有可信度。

線粒體功能障礙在Aβ 沉積聚集或記憶障礙的發展之前就發現了裂變、融合和功能異常，具體反映在ROS 水平升高，Ca2+穩態破壞，脂質過氧化以及細胞凋亡上[1，10]。抗氧化能力的降低直接影響神經元的突觸活動和神經傳遞，從而導致認知功能障礙[10]。受ROS 影響的分子靶標包括核和線粒體DNA、脂質、蛋白質、鈣穩態、細胞結構、受體運輸和內吞作用以及能量穩態。反之，異常的細胞代謝會影響Aβ 和磷酸化tau 蛋白的產生和積累，從而獨立加劇線粒體功能障礙和ROS的產生，形成惡性循環。在正常情況下，充當自由基清除劑的抗氧化劑酶介導ROS的水平，包括SOD 和GSH-PX；同時ROS 可將多不飽和脂肪酸氧化為過氧化脂肪酸，后者進行重排并進一步反應以形成多種次級氧化產物，如MDA，進而影響線粒體呼吸鏈中關鍵酶的活性，嚴重損傷細胞膜[4]。以上指標均用于評估氧化應激反應程度。線粒體在細胞中還具有調節程序性細胞死亡或凋亡作用。據報道[1]，通過TUNEL 染色評估，與健康的大腦相比，AD 大腦中的神經元顯示出凋亡的標志。Bcl-2家族的抗凋亡和促凋亡成員之間的均衡參與并維持線粒體完整性，Bcl-2 與Bax的比值對細胞存活和死亡至關重要。Bcl-2 在抑制凋亡、損傷后修復等方面有重要意義；Bax 可改變線粒體外膜通透性，促使細胞色素-C 從線粒體釋放到胞質，產生細胞內源性凋亡。細胞凋亡遵循與腫瘤壞死因子受體家族成員相關的外源性途徑，同樣遵循與從線粒體中釋放細胞色素C的內源性途徑；兩種途徑最終在半胱氨酸天冬氨酸酶級聯反應的末端部分合并。級聯反應的最后一步是激活Caspase-3，促使細胞內蛋白水解，細胞骨架崩潰和DNA 片段化。因此，Caspase-3 被認為是凋亡細胞的通用指標[11]。

Sal B 是天然有效的抗氧化劑，含有9 個酚羥基，因此它可以提供許多氫原子以發揮強大的抗氧化作用，通過抑制聚（ADP-核酶）聚合酶1（PARP-1）活性以防止NAD+消耗、上調Grx1 表達，從而有效抑制ROS的產生并減少脂質過氧化產物如MDA的產生，以發揮抗氧化作用[4]。有研究表明[12]，Sal B可顯著改善過氧化氫誘導的神經干細胞體外損傷，并促進其向神經元分化；還能夠改善小鼠暫時性腦缺血誘導的學習與記憶功能障礙。同時，Sal B 可以通過降低細胞線粒體內鈣濃度來降低Caspase-3 活性，減少皮層神經元和肝細胞等細胞凋亡[13]。Yu X等[14]研究發現，SalB 治療激活了AKT/CREB/BDNF信號通路，抑制神經元凋亡發揮抗驚厥作用。

本實驗結果顯示，與AD 模型組比較，Sal B 增加小鼠腦組織和血清中SOD、GSH-PX 含量，減少MDA 含量，增加小鼠海馬Bcl-2 蛋白表達增加，減少Bax、Caspase-3 蛋白表達，表明Sal B 可能通過調節OS 反應中相關酶的活性改善氧化損傷，繼而減輕線粒體損傷，進一步調節Bcl-2 與Bax 比值，抑制Caspase-3 凋亡蛋白表達，改善小鼠海馬神經元凋亡。

綜上所述，Sal B 對AD 小鼠的認知功能具有一定的保護作用，其作用機制可能與改善OS 損傷從而減少神經元凋亡有關。說明Sal B 可能是治療神經退行性疾病的有效藥物。在臨床試驗之前，仍需要進一步研究來驗證Sal B 對抗其他AD 模型通過其他靶點的抗老年癡呆作用。