MicroRNA-613調控ATOH1 和FMNL2對結腸癌發生發展的影響

查作霖，陳福軍

（佳木斯大學附屬第一醫院肛腸科，黑龍江 佳木斯 154007）

目前，結腸癌（colon cancer）已成為最常見的惡性腫瘤之一，每年有超過100 萬新發病例[1]。盡管結腸癌的治療方法多種多樣，但結腸癌患者的生存率仍然很低[2]。結腸癌的發生和發展與很多代謝與分子機制相關[3]。因此，了解結腸癌發生和發展的分子機制，發現新的分子診斷標志物和治療靶點的藥物具有重要意義。越來越多的醫學研究表明微小RNA（MicroRNA）參與了結腸癌的發生和發展。MicroRNA-613 在許多癌癥中有抑癌作用。然而，關于MicroRNA-613 在結腸癌中的具體分子機制和調控作用尚不清楚。MicroRNA 是大小為19～25 個核苷酸的內源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3’-UTR結合從而負調控基因表達[4-6]。MicroRNA 在許多不同的生物代謝過程中起著至關重要的作用，包括細胞增殖、分化和凋亡等[7,8]。MicroRNA-613 在結腸癌組織和患者血液樣本中表達增加，其可能抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并在G1期誘導細胞周期阻滯。通過生物信息學分析發現，在結腸癌細胞中，ATOH1 和FMNL2的mRNA的3’-UTR 與MicroRNA-613 有結合位點。且ATOH1 和FMNL2的異常表達可能影響MicroRNA-613 誘導的結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[9,10]。這些研究結果表明MicroRNA-613 通過調節ATOH1 和FMNL2 在結腸癌的發展中發揮重要作用。本研究重點驗證MicroRNA-613 在結腸癌發生和發展中的作用及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 miRcute 血清/血漿miRNA 提取分離試劑盒（天根生化科技有限公司）；miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）；miRNA熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）；無RNA 酶雙蒸水（天根生化科技有限公司）；miRNA 檢測引物has-U6（天根生化科技有限公司）；miRNA 檢測引物has-miR-613（天根生化科技有限公司）等。

1.2 實驗儀器 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）、瓊脂糖凝膠電泳儀（美國BIO-RAD 公司）、反轉錄PCR（美國ABI 公司）、Eppendorf U410-86 低溫冰箱（德國eppendorf 公司）、上海天能Tanon 凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 組織標本收集 收集2019 年12 月-2020 年12月在佳木斯大學附屬第一醫院肛腸科手術治療的結腸占位患者的結腸癌組織及癌旁正常腸組織，包括病理低分化、高分化和正常組織各20 例，分別作為輕度組、重度組和對照組。組織標本離體后迅速冷凍至液氮中，并保存在-80 ℃冰箱中，直至RNA 提取。納入標準：①病理確診為結腸癌、TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期的患者，且手術方式為根治性手術；②未接受過任何腫瘤相關性手術、放化療及其他腫瘤相關治療；③為原發腫瘤。排除標準：合并心、肝、腎等其他器官功能障礙者。

1.3.2 血液標本收集 采集所有受檢者清晨空腹靜脈血10 ml，室溫下3000 r/min 離心10 min，移去細胞或細胞碎片；收集上層血清，然后在4 ℃，3000 r/min 離心10 min，進一步除去殘留血細胞；小心吸取上層血清至新的離心管，置于80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 qRT-PCR 檢測miR-613 表達 應用實時熒光定量PCR 技術（qRT-PCR）檢測各組組織標本、血液標本中miR-613的表達水平，比較各組表達水平的差異。組織標本、血液標本中的miRNA 提取分離；合成miRNA cDNA 第一鏈瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA。反轉錄程序：①RNA 加A 尾反應和反轉錄反應42 ℃，60 min；②酶失活反應95 ℃，3 min。miRcute增強型miRNA 熒光定量檢測；按實驗樣本數量計算各試劑總量，分裝到反應管中，最后加入反應體系中的自備引物和miRNA cDNA。按順序加入試劑：2×miRcute 增強型microRNA 定量預混試劑、Reverse Primer、50×ROX 對照染料和引物，加入1.5 ml 無RNA 酶離心管中，最后加入樣本的cDNA。混勻，離心，上機，設置反應程序，觀察結果。

1.3.4 ELISA 實驗 酶聯免疫吸附法（ELISA）定量測定結腸癌患者組織Atoh1，FMNL2的水平。

1.3.5 Western Blot 分析FMNL2 和Atho1 表達 蛋白裂解：組織加入裂解液，4 ℃裂解2 h 后，12,000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清，放于液氮罐或-80 ℃冰箱中，每次電泳之前進行蛋白測定。裂解蛋白的含量測定，蛋白質的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗、二抗反應，顯色反應，凝膠圖象分析。

1.4 統計學方法 所有實驗數據采用SPSS 25.0 軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以（）表示，組間比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性采用Pearson 線性相關分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電泳情況 miRNA 經逆轉錄生成cDNA 后，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果見圖1。qRT-PCR 檢測各組樣本，溶解曲線分析未見雜峰，擴增產物單一，沒有非特異性擴增，所有樣品均己進入擴增平臺期，反應條件設定準確。

圖1 組織樣本cDNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 各組組織勻漿中ATOH1 和FMNL2 表達比較對照組、輕度組、重度組組織勻漿中ATOH1 表達量逐漸升高，各組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組、輕度組、重度組組織勻漿中FMNL2 表達量逐漸降低，各組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組組織勻漿中ATOH1 和FMNL2 表達比較（，ng/ml）

表1 各組組織勻漿中ATOH1 和FMNL2 表達比較（，ng/ml）

注：**表示與對照組比較，P＜0.05

2.3 各組組織中ATOH1 和FMNL2 表達比較 對照組、輕度組、重度組組織中ATOH1 表達量逐漸升高，各組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組、輕度組、重度組組織中FMNL2 表達量逐漸降低，各組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖2、圖3。

表2 各組組織樣本中ATOH1 和FMNL2 表達量比較（）

表2 各組組織樣本中ATOH1 和FMNL2 表達量比較（）

注：**表示與對照組比較，P＜0.05

圖2 Western Blot 分析FMNL2的表達

圖3 Western Blot 分析ATOH1的表達

2.4 各組組織樣本中miRNA-613 表達比較 對照組、輕度組、重度組miRNA-613 表達水平逐漸升高，且各組miRNA-613 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組組織樣本中miRNA-613 表達比較（）

表3 各組組織樣本中miRNA-613 表達比較（）

注：**表示與對照組比較，P＜0.05

2.5 miRNA-613 和ATOH1、FMNL2的相關性 Pearson 相關性分析顯示，miRNA-613 和ATOH1、FMNL2 表達均呈負相關，見表4。

表4 miRNA-613 與ATOH1 和FMNL2的相關性

3 討論

miRNA 是一類重要的小分子，在轉錄后調控蛋白質過程中發揮重要作用。越來越多的研究表明，miRNA的表達失調與結腸癌的發生發展有關。miRNA-613 在許多癌癥中起著抑癌作用，但目前miRNA-613 在結腸癌進展中的確切作用尚不清楚。結腸癌的發生是由于癌細胞無限增殖和不受調控，癌基因和原癌基因被激活，抑癌基因被抑制引起的[11]。研究認為，miRNA 和蛋白質表達量的變化和結腸癌的發生密不可分。

研究發現[12]，miRNA-613 通過靶向ATOH1 促進結腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，該研究發現了miRNA-613 在結腸癌中的表達和功能，并闡明了miRNA-613調控結腸癌進展的分子機制。另外，miRNA-613 在結腸癌組織樣品和人結腸癌細胞系中上調，這也促進了增殖、侵襲和遷移的結腸癌細胞數量。雙重熒光素酶報告基因測定證實ATOH1 是miRNA-613的目標mRNA，Jun N 端激酶1（JNK1）通路和粘蛋白2（MUC2）是miRNA-613/ATOH1的潛在下游蛋白。另有研究發現[13]，miRNA-613 可靶向FMNL2 并抑制結腸癌的進展。miRNA-613 在結腸癌細胞系和組織樣本中表達量的變化，說明其可抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導G1期細胞周期停滯。而FMNL2 是結腸癌細胞中miRNA-613的直接結合靶點，FMNL2的過表達可影響miRNA-613 誘導的結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。因此，目前研究認為miRNA-613 主要通過調節FMNL2 在結腸癌的表達發揮抑癌作用。

本次研究顯示，各組樣本中miRNA-613的表達水平均高于對照組，同時重度組高于輕度組，差異有統計學意義（P＜0.05）。ELISA 實驗表明，與對照組相比，ATOH1 表達增高，且重度組高于輕度組；而FMNL2 表達降低，且重度組低于輕度組。另外，通過miRNA-613 與ATOH1 和FMNL2的相關性分析發現，miRNA-613的表達和ATOH1、FMNL2的表達均呈負相關（P<0.05），說明miRNA-613 是結腸癌的致癌基因，并通過靶向ATOH1、FMNL2促進結腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，其可能是通過激活JNK1 途徑和上調MUC2 發揮作用，miRNA-613 有望成為治療結腸癌的新藥物的干預靶點。miRNA-613調控ATOH1 和FMNL2 在結腸癌發生發展中有重要的分子作用，進而可以作為預測結腸癌嚴重程度的分子指標[14-16]。未來，miRNA-613、ATOH1 和FMNL2 可能成為臨床上快速診斷結腸癌的重要分子標志物。

綜上所述，miRNA-613 通過影響ATOH1 和FMNL2的表達，從分子水平上調控結腸癌的發生發展。另外，miRNA-613的表達與ATOH1 和FMNL2均呈負相關，可互相作為分子標志物。但是其調控結腸癌具體分子機制尚未完全明確，還需進一步的研究驗證。