熱休克蛋白A12A改善內毒素血癥肺損傷的實驗研究

戴媛 劉嘉莉 閔新栩 李蘊凡 毛芊 丁正年

老年人感染發生率高，容易進展為膿毒癥、感染性休克，導致多器官損傷和功能障礙，威脅病人生命[1]。肺臟是膿毒癥/感染性休克的重要受累器官之一[2]。研究顯示，感染導致的嚴重肺損傷死亡率高達27%，是ICU內死亡的獨立相關危險因素[3]。因此，深入揭示膿毒癥/感染性休克所致肺損傷的發病機制，對發現并鑒定新的有效治療措施有積極意義。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類進化保守的分子伴侶，根據分子量大小可分為HSPA/HSP70、HSPB/HSP27、HSPC/HSP90、HSPH/HSP110以及DNAJ/HSP40等幾個亞家族[4]。一些HSP如HSP70、HSP90被證實可顯著減輕膿毒癥/感染性休克肺損傷[5-6]，但尚未能成功臨床轉化，可能有更多其他HSP參與肺損傷的發生發展。

HSPA12A因其含有不連續ATP酶結構域，被認為是HSPA/HSP70家族的不典型成員。本團隊的前期研究顯示，HSPA12A在肥胖、非酒精性脂肪肝、腫瘤發生發展中具有重要作用[7-8]。但尚不清楚HSPA12A是否參與膿毒癥、感染性休克肺損傷。本研究采用HSPA12A表達沉默的基因敲除鼠，探索HSPA12A在細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所誘導的內毒素血癥肺損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 以C57BL/6為基因背景的Hspa12a基因敲除(Hspa12a-/-)鼠由本課題組前期構建完成[9]。本研究采用8～10周齡雄性小鼠用于實驗，對照組采用一窩所生、同性別、野生型(WT)小鼠。實驗動物飼養于南京大學模式動物研究所，并得到相應實驗動物倫理學批準。

1.2 實驗試劑 Escherichia coli LPS (0111:B4)、甲醛、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體為Bioworld Technology公司產品(St. Louis，MN，美國)，抗HSPA12A抗體為Abcam公司產品(Cambridge，英國)，High-sig ECL western blotting 底物為天能公司產品(上海，中國)，BCA蛋白質測定試劑盒為Pierce產品 (Rockford，IL，美國)。

1.3 誘導內毒素血癥 將WT鼠和Hspa12a-/-鼠分別分為2組，NS-WT組和LPS-WT組，NS-Hspa12a-/-組和LPS-Hspa12a-/-組(n=7)。LPS-WT組和LPS-Hspa12a-/-組進行LPS (5 mg/kg)單劑量腹腔注射,NS-WT組和NS-Hspa12a-/-組注射等體積生理鹽水。6 h后進行相應分析。

1.4 血氣分析 LPS或生理鹽水腹腔注射后6 h, 以1.5%異氟烷麻醉小鼠，氣管插管、機械通氣，然后從左心室抽取動脈血液，用iSTAT Analyzer MN:300 (Abbott Park, IL,美國)進行血氣分析。

1.5 組織學分析 LPS或生理鹽水腹腔注射后6 h, 收集肺組織進行甲醛固定、石蠟切片以及HE染色，并在顯微鏡下觀察(Olympus, 日本)。肺損傷評分按美國胸科協會制定的肺損傷量表進行評分[10]。見表1。

表1 肺損傷評分量表

1.6 免疫印跡(Western blot) LPS或生理鹽水腹腔注射后6 h, 收集肺組織提取蛋白質，測定蛋白質濃度后，以等量蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后按順序進行轉印、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯影。以抗GAPDH的印跡為上樣內參。

2 結果

2.1 HSPA12A在內毒素血癥小鼠肺組織中表達升高 本研究按照文獻采用革蘭氏陰性菌細胞壁主要致病成分LPS進行小鼠腹腔注射，誘導肺損傷的動物模型[11]。免疫印跡結果顯示，LPS刺激使小鼠肺組織中的HSPA12A蛋白水平升高到對照組的1.5倍 (1.45±0.42比1.00±0.09，P<0.05)。見圖1。

圖1 NS-WT組和LPS-WT組HSPA12A蛋白水平比較

2.2Hspa12a基因敲除加重內毒素血癥小鼠肺組織學改變 顯微鏡觀察顯示，WT鼠和Hspa12a-/-鼠的肺組織在LPS作用后均受到損傷，主要表現為肺泡腔和肺間質中的中性粒細胞浸潤、肺泡內蛋白碎片沉積、肺泡壁增厚等病理改變。見圖2。根據肺損傷量表進行評分后發現，LPS作用后，Hspa12a-/-鼠肺損傷較WT鼠顯著加重 (P<0.01)，見表2。

圖2 WT鼠和Hspa12a-/-鼠的肺組織病理圖像(HE，×20)

表2 小鼠肺組織肺損傷評分 分，n=6)

2.3Hpa12a基因敲除加重肺功能損害 與LPS-WT鼠相比，LPS-Hspa12a-/-鼠動脈血中總CO2(TCO2)以及CO2分壓(PCO2)均顯著升高 (P<0.05)。見表3。

表3 小鼠動脈血氣分析

3 討論

本研究發現,內毒素血癥小鼠肺組織中HSPA12A表達水平升高，而Hspa12a基因敲除則加重內毒素血癥肺損傷，提示HSPA12A在膿毒癥/感染性休克肺損傷發生發展中具有重要作用。

感染所致肺損傷涉及多重信號網絡形成的復雜病理生理過程，至今尚未完全闡明[12]。然而，肺泡壁水腫和肺泡內滲出造成的彌漫性肺損傷是其無可非議的、公認的關鍵病理特征[12]。此外，以中性粒細胞為主的白細胞聚集、纖維蛋白沉積也是此類肺損傷的常見病理改變。由于至少50%的膿毒癥/感染性休克由革蘭氏陰性菌引起，而LPS是位于革蘭氏陰性菌細胞壁上的主要致病成分，也稱內毒素，因此，LPS常被用于膿毒癥/感染性休克的實驗動物模型的誘導[13]。本研究給予小鼠5 mg/kg LPS單劑量腹腔注射，6 h后觀察發現，小鼠肺組織出現肺泡壁間質和肺泡內白細胞滲出、肺泡壁水腫等典型的肺損傷病理改變，并且血氣分析顯示小鼠體內CO2過度蓄積，這些結果都提示小鼠出現了肺損傷。值得關注的是，上述LPS所致的肺組織損傷和肺功能損害在Hspa12a基因敲除鼠中顯著加重，提示HSPA12A是保護膿毒癥、感染性休克所致肺損傷所必需的。

現有研究證據顯示，膿毒癥/感染性休克肺損傷的病理改變主要與內皮細胞損傷、上皮細胞損傷、炎癥細胞招募和浸潤等因素有關。內皮細胞是肺泡壁的重要組成結構并形成血管屏障，控制分子、細胞進出，在肺泡氣體交換、肺泡壁完整性方面的作用極其重要。LPS等細菌致病成分可導致內皮細胞凋亡(apoptosis)、焦亡(pyroptosis)，從而損傷內皮屏障功能，導致肺泡蛋白成分、炎癥細胞等滲出，而滲出的炎癥細胞誘導炎癥反應，產生大量炎癥因子，對肺組織形成二次損傷。此外，肺上皮細胞損傷也是膿毒癥/感染性休克肺損傷的重要病理改變。本研究結果顯示，Hspa12a基因敲除可加重LPS所致的肺損傷，但其作用機制是否與內皮細胞、上皮細胞或炎癥細胞有關有待進一步闡明。本團隊前期研究顯示，Hspa12a可調控癌變的腎小管上皮細胞增殖和遷移、肝臟巨噬細胞活化[7]，提示HSPA12A在肺泡上皮細胞、炎癥細胞的浸潤和激活中可能也具有某種作用。此外，作為HSPA12A的高度同源基因HSPA12B，可顯著抑制LPS所致的內皮細胞損傷、維持內皮屏障功能、限制內皮細胞與炎癥細胞之間的交互作用[14]。結合HSPA12A參與腦卒中后血管新生的報道[9]，提示我們未來值得從內皮細胞的角度探索HSPA12A對膿毒癥/感染性休克肺損傷的保護機制。

綜上，本研究發現Hspa12a是一個內毒素血癥肺損傷的新型保護基因，但其作用機制尚有待進一步闡明。