三陰性乳腺癌組織中FGFR1蛋白水平及Ki67表達與微血管密度的關系分析

徐超 韓正祥 周雷 孫波

乳腺癌是臨床較為常見的惡性腫瘤之一[1]。流行病學調查顯示，全世界乳腺癌的每年新發病例為140萬，乳腺癌的發病率在發展中國家以及發達國家中呈逐年上升的趨勢[2]。在乳腺癌的疾病進展中，雌激素受體(ER)和孕激素受體陽性病人的比例高達70%，在對此類病人的治療中，通過診療技術的不斷革新，其預后較好[3]。三陰性乳腺癌 (triple negative breast cancer, TNBC)主要是指ER、孕激素受體以及人表皮生長因子受體均為陰性的乳腺癌病人。研究顯示，TNBC對常規的化療方案的敏感性較差，靶向治療效果不理想[4]。成纖維細胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)在腫瘤細胞的生長以及分化過程中發揮重要的生物學作用。FGFR1主要通過基因的突變、差異性表達以及融合蛋白等進一步導致酪氨酸酶受體活化，進一步造成腫瘤進展[5]。增殖細胞的相關抗原Ki67與腫瘤細胞的增殖水平具有顯著相關性[6]。本研究主要通過分析TNBC組織中FGFR1蛋白水平及Ki67表達與微血管密度(microvessel density,MVD)的關系，為疾病進展提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性研究，以2018年5月至2019年3月在我院進行診斷并治療的140例乳腺癌病人作為研究對象，其中TNBC病人(TNBC組)100例，非TNBC病人(非TNBC組)40例，年齡60～75歲，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期81例，Ⅲ～Ⅳ期59例。納入標準：(1)所有病人均符合乳腺癌診斷標準[7]；(2)病人入組前均未接受抗腫瘤治療；(3)病人的ER狀態均經病理學結果確認。排除標準：(1)合并其他腫瘤；(2)術前接受新輔助化療；(3)有其他腫瘤家族史。2組年齡、BMI、TNM分期差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。所有病人均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會論證通過。

表1 2組病人的基線資料比較

1.2 研究方法 對所有病人均進行病理學活檢，將以上樣本進行石蠟包埋后，切割成厚度為4μm的石蠟組織切片，對病人的病灶組織進行常規脫蠟后，使用3%的過氧化氫溶液浸泡8 min，采用PBS溶液沖洗3遍，浸泡于0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液，使用微波爐對病人的抗原修復15 min，自然冷卻后，采用新鮮的FGFR1、Ki67、MVD抗體進行滴加，在4 ℃的恒溫冰箱過夜后，再次使用PBS溶液進行沖洗，使用聚合酶輔助劑對病人的組織標本進行滴加后，37 ℃恒溫培養30 min，再次使用PBS溶液進行沖洗后，使用辣根酶標記的羊抗兔以及小鼠IgG滴加，37℃恒溫培養30 min，采用DAB進行顯色以及復染，使用已知的組織切片作為參照，對病人的FGFR1、Ki67、MVD水平進行檢測。根據病人的染色情況進行評分，無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；陽性細胞的比例：病人的陽性細胞比例在5%以下為0分， 5%～25%為1分， 26%～50%為2分， 51%～75%為3分， 76%～100%為4分。以染色情況以及陽性細胞比例的乘積作為病人FGFR1、Ki67、MVD的表達量。所有免疫組化檢查均由2位高年資病理醫師雙盲判讀。

1.3 觀察內容 (1)對TNBC組以及非TNBC組的FGFR1、Ki67、MVD水平進行比較；(2)對不同年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉移情況的FGFR1、Ki67、MVD水平進行比較；(3)對TNBC病人的FGFR1、Ki67表達水平與MVD水平進行相關性分析。

2 結果

2.1 2組FGFR1、Ki67、MVD水平比較 TNBC組與非TNBC組的MVD水平差異無統計學意義(P>0.05)，TNBC組FGFR1、Ki67的表達水平均顯著高于非TNBC組(P<0.01)。見表2。

表2 2組病人的FGFR1、Ki67、MVD水平比較

2.2 TNBC組中不同病理學特征病人的FGFR1、Ki67、MVD水平比較 TNBC組中不同腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉移病人之間FGFR1、Ki67、MVD水平的差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同病理學特征TNBC病人FGFR1、Ki67、MVD表達水平比較

2.3 相關性分析 相關性分析顯示，TNBC病人的腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉移、MVD水平與FGFR1、Ki67表達水平呈正相關(均P<0.01)。見表4。

表4 相關性分析(r)

3 討論

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，約占女性惡性腫瘤的30%[8]。與非TNBC相比，TNBC具有較強的侵襲性以及進展性,病人的生存質量以及生存時間顯著降低。目前臨床對于TNBC發病機制的研究尚不明確，在臨床治療中，通過對腫瘤標志物相關蛋白質以及抗腫瘤靶向物質的尋找成為目前基礎研究的重點。在非TNBC病人中，病人的HER-2呈現顯著的活性。在乳腺癌病人中，隨著病人HER-2活性的顯著升高，其對腫瘤細胞的生長、分化、分裂呈現出顯著的催化作用。有報道指出，病人的HER-2蛋白的表達水平與腫瘤的體積、組織學分級、淋巴結轉移等情況顯著相關。

在對乳腺癌病人的疾病進展的研究表明，FGFR1在10%的乳腺癌病人中存在一定的擴增，而該基因的擴增與機體的FGFR1蛋白過度表達顯著相關。隨著機體的FGFR1蛋白水平的不斷提升[9]，乳腺癌病人的轉移風險顯著升高，生存率下降。在較低分化的乳腺癌病人以及ER陽性的乳腺癌病人中，FGFR1蛋白與其生存情況存在顯著相關[10]。本研究結果顯示，與非TNBC病人相比，TNBC病人的FGFR1蛋白水平顯著升高，病人的預后較差。在正常的生理作用下，FGFR1蛋白的表達可顯著促進絲裂原激活蛋白激酶以及蛋白激酶b的轉錄，最終造成管腔上皮細胞的生長以及分化[11]。在FGFR1蛋白的異常表達中，絲裂原激活蛋白激酶以及磷脂肌醇3激酶的信號被異常激活，進而造成腫瘤細胞的異常增生。而在腫瘤細胞的異常性增生過程中，需要大量的營養物質，新生血管的密度水平將顯著升高，本研究也發現，乳腺癌病人的FGFR1蛋白水平與MVD呈現顯著相關性。

Ki67在正常的乳腺組織中表達較為少見，在惡性腫瘤細胞中的表達水平較高。有研究顯示，Ki67與惡性腫瘤細胞的侵襲能力以及惡性程度顯著相關[12]。國外有研究顯示，Ki67的異常高水平表達是預后較差的重要指征，正常的乳腺組織Ki67的表達水平不會超過3%，而在乳腺癌組織的疾病進展中，Ki67水平介于3%～14%，則有利于乳腺癌病人的生存率[13]。同時，在對TNBC病人的基因突變的分析顯示，在共線性模型中，rs3213849位點的G等位基因的突變，可能會造成病人的不良預后。王宇航等[14]對女性乳腺癌的發病風險的研究認為，Ki67水平的異常升高與疾病的不良預后具有顯著相關性，與本研究相互印證。

另外，在相關性分析中，病人的腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉移、MVD水平與FGFR1、Ki67表達水平呈正相關(均P<0.01)；而在對TNBC以及非TNBC的MVD水平的分析中，2組病人的MVD水平差異無統計學意義。提示，ER不同狀態病人的MVD并不存在差異，利用MVD水平對疾病進展的預測能力不足，而通過對病人的FGFR1、Ki67水平的檢測，可再進一步代替MVD水平的預測能力，同時兼顧TNBC以及非TNBC病人的差異。

綜上所述，TNBC組織中FGFR1、Ki67的表達與MVD呈現顯著相關性，未來可通過對病人的FGFR1、Ki67聯合檢測，進一步對病情進展進行分析。