鈣化性心瓣膜病合并肺動脈高壓病人血清miR-222、白細胞介素-6、腦鈉肽水平分析

周華蘭 林森 李霞 徐培敬 胡有東

鈣化性心瓣膜病(calcified valvular heart disease，CVHD)又稱退行性心臟瓣膜病，與傳統觀點相反，CVHD不是一種被動的退行性疾病，而是一種動態疾病。瓣膜小葉最初的細胞變化發展為纖維化病變，導致瓣膜增厚和鈣化，晚期增厚和鈣化損害瓣膜功能，在沒有干預的情況下，心室肥厚逐漸發生，最終導致心力衰竭和死亡。左心疾病相關性肺動脈高壓(PH-LHD)主要由左心疾病引起，是肺動脈高壓(PH)的常見類型之一，具有患病率高、預后差等特點。而對于左心瓣膜疾病尤其是CVHD合并PH的研究目前較少。多項研究表明，微小RNAs(miRNAs)及炎性反應參與了瓣膜病的發生、發展[1-2]。本研究旨在探討CVHD及合并PH的病人微小RNA-222(miR-222)、IL-6、hs-CRP、N末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)的水平變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年8月至2019年5月在我院住院的CVHD病人158例，分為CVHD合并PH組(72例)及無PH的單純CVHD組(86例)，其中CVHD合并PH組男38例, 女34例, 年齡60～80歲，平均(72.61±4.89) 歲；單純CVHD組男45例, 女41例, 年齡60～80歲，平均(72.15±5.57) 歲。另選30名健康體檢者作為對照組，男16例, 女14例, 年齡60～80歲，平均(72.80±5.00) 歲。所有入選者均進行超聲心動圖檢查。PH-LHD以心臟多普勒彩超為主要診斷標準，采用三尖瓣反流法估算的肺動脈收縮壓(SPAP)值進行診斷：靜息狀態下經胸超聲心動圖測得SPAP>40 mmHg,且符合《中國肺高血壓診斷和治療指南2018》中PH-LHD臨床分類。排除標準:風濕性心臟瓣膜病、先天性心臟瓣膜病、膠原病及感染性心內膜炎所致的瓣膜病變。3組間年齡、性別、BMI、FPG、TG、TC、SBP、DBP比較差異均無統計學意義(P>0.05)， 具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準, 且所有入選者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集：所有入選者抽取空腹肘靜脈血4 mL，離心后吸取血清，保存于-80 ℃冰箱待下一步檢測。

1.2.2 血清miR-222的相對表達量檢測：Trizol-離心柱法提取總RNA，檢測時先進行復溫, 由INVITROGEN公司提供的Trizol試劑盒提取總RNA， 嚴格按照說明書, 提取血清總RNA。將總 RNA 逆轉錄為互補 DNA(cDNA)，再經實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測方法特異性擴增，獲單一熔解曲線峰(試劑盒由GeneCopoeiaTM公司提供)，軟件分析得到 Ct 值，以Ct值表示miR-222表達水平，以U6作為內參照，由公式2-△△Ct計算各個樣本中的miRNA相對表達量。

1.2.3 血清IL-6檢測：采用ELISA法，檢測儀為RAYTO RT-6000，試劑盒由上海拜力生物科技有限公司提供。嚴格按照說明書進行操作。

1.2.4 血清hs-CRP 檢測：使用美國BECKMAN公司生產的特種蛋白免疫散射濁度分析儀AU5800檢測，采用免疫比濁法，試劑盒由上海百蕊生物有限公司提供。正常參考值≤3 mg/L。

1.2.5 血清NT-proBNP 檢測：采用法國MERCK公司提供的原裝進口試劑盒，采用化學發光法，嚴格按照說明書進行操作。

2 結果

2.1 3組血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平比較 CVHD病人血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)，且CVHD合并PH組較單純CVHD組升高更顯著(P<0.01)。 見表1。

表1 3組血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平比較

2.2 相關性分析 直線相關分析表明，所有CVHD病人IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平與miR-222水平均呈正相關(r=0.438、0.384、0.540，P均<0.01)。

3 討論

microRNA(miRNA)是一類內源性、非編碼小RNA分子，可通過特異性作用降解mRNA或在轉錄后水平通過抑制翻譯、誘導降解等方式調節相應靶基因表達。miRNA在機體健康的不同階段和疾病不同時期的表達量發生顯著變化，且具有細胞、組織特異性，在血液、組織、細胞中檢測到穩定的不同濃度miRNA，可作為潛在的診斷疾病的生物標記物或防治靶點。miR-222作為miRNAs家族中的重要一員，在細胞增殖、分化、凋亡、炎性反應及多種生物組織的調節過程中發揮著重要作用。據報道，miR-222可能通過基質金屬蛋白酶1的表達調控增生性瘢痕組織中成纖維細胞的生存能力[3]。鈣化性主動脈瓣疾病中長鏈非編碼RNA H19 DNA甲基化改變通過沉默NOTCH1促進其鈣化[4]；在大鼠難治性骨折模型中，局部應用miR-222抑制劑可以促進成骨、軟骨形成和血管生成，從而加速骨愈合[5]。本研究發現，CVHD病人血清miR-222水平明顯高于對照組，且CVHD合并PH組較單純的CVHD組病人血清miR-222水平升高更顯著。有報道，PH病人的冠狀動脈中，由于miR-223/DNA損傷/Poly核糖聚合酶1/miR-204軸激活和隨后的溴域蛋白4過表達，促進了血管的重構和共病發展[6]。

本研究表明，CVHD尤其是合并PH的CVHD病人血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平明顯升高，提示miR-222及炎性反應(如IL-6、hs-CRP)等可能參與了CVHD的進展及預后。各種左心疾病包括CVHD，隨著病情進展，左心室壓力升高導致肺血管重構，血清NT-proBNP水平升高，肺動脈壓力升高。在CVHD中，向鈣化和骨化發展的過程是以瓣膜增厚為先導的，這是由于脂質、炎性細胞的積累，以及隨后在瓣膜細胞外基質中的紊亂所致。而且，本研究還發現，所有CVHD病人IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平與miR-222水平呈正相關。提示炎性反應可能加速了瓣膜鈣化的進程，引起左心功能不全、PH。有關miRNA通過炎性反應參與心臟衰老調控的更進一步探討顯示，miRNA let-7通過抑制心臟IL-6和多個膠原蛋白的表達，從而抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心臟炎癥反應及纖維化[7]；miR-222參與了缺氧誘導的肺動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移[8]。

因此，miR-222、IL-6及NT-proBNP聯合使用可能對CVHD的病情評估及臨床防治提供幫助。由于本研究的樣本較少，尚需進一步的大樣本前瞻性臨床研究來驗證其未來的作用。