miR-23a/SATB2信號通路對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移的影響

高永濤 白 浪 樊 華 劉 濤 姬 樂 雷 星 鄧世波 袁江濤

結(jié)直腸癌(CRC)的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的惡性生長、轉(zhuǎn)移及凋亡減少有關(guān)，并且這些腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性與基因調(diào)控有關(guān)，通過研究基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞功能探討腫瘤發(fā)生機(jī)制，對于分子靶向治療腫瘤具有重要意義[1]。miRNA在疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，目前已知miRNA在心血管系統(tǒng)疾病、缺氧損傷中扮演著關(guān)鍵角色，miRNA還可作為疾病治療的靶點(diǎn)[2]。miR-23a參與了細(xì)胞發(fā)育過程中的不同階段，如細(xì)胞增殖、變異、凋亡等，對于骨骼肌和神經(jīng)的發(fā)育起著重要作用[3-4]。近年來的研究表明，miR-23a與人類腫瘤關(guān)系密切，在許多腫瘤(膠質(zhì)瘤、口腔鱗癌、胰腺癌)中發(fā)揮著促癌作用，靶向下調(diào)miR-23a的表達(dá)可抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[5-7]。既往研究顯示，miR-23a在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，并且具有促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖的作用[8]。目前對于miR-23a在CRC細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)移中的作用和調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本研究以CRC SW480細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，探討在體外下調(diào)miR-23a表達(dá)對CRC細(xì)胞惡性表型的作用，為尋找有效的CRC分子治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

CRC SW480細(xì)胞購自微蒙生物科技(上海)有限公司；兔多抗[剪切的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(C-Caspase-3)抗體]、特殊富含AT序列結(jié)合蛋白2(SATB2)抗體購自美國Abcam公司；miR-23a抑制劑(inhibitor)、inhibitor對照(control)由吉滿生物科技(上海)有限公司合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體購自美國Santa Cruz公司；熒光素酶報告載體由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司合成；miR-23a模擬物(mimics)和mimics control由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；CCK-8增殖檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；SATB2小干擾RNA(siRNA)、siRNA control由上海美軒生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)SW480細(xì)胞匯合度約為40%時，采用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，操作步驟按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor、inhibitor control后的 SW480細(xì)胞記為Anti-miR-23a、Anti-NC，將沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞記為對照(Control)。

1.3 定量RT-PCR法檢測miR-23a表達(dá)

取培養(yǎng)48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細(xì)胞，添加TRIzol試劑，提取細(xì)胞中的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，cDNA保存在-20 ℃冰箱。定量RT-PCR(qRT-PCR)反應(yīng)體系如下：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2.5 μL cDNA，添加RNAse free水至25 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。內(nèi)參為U6，按照2-△△Ct法計(jì)算miR-23a mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細(xì)胞接種到96孔板中，每個孔內(nèi)加100 μL細(xì)胞懸浮液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，添加10 μL CCK-8溶液，置于避光條件下孵育4 h。在酶標(biāo)儀上測定OD值，波長為450 nm。

1.5 平板克隆法檢測細(xì)胞克隆能力

將轉(zhuǎn)染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細(xì)胞接種到6孔板中，每個孔內(nèi)添加1 000個細(xì)胞，添加2 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)13 d后，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞團(tuán)形成。用PBS洗滌細(xì)胞團(tuán)，添加0.1%結(jié)晶紫工作液將細(xì)胞染色，在顯微鏡下觀察超過50個細(xì)胞的克隆形成數(shù)目。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡

取培養(yǎng)48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細(xì)胞，用PBS洗滌后，每組收集約1×106個細(xì)胞，用PBS溶液懸浮洗滌后，添加250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，過400目網(wǎng)篩，添加5 μL Annexin V-FITC溶液染色后，混合均勻，在避光條件下孵育20 min。添加PI染色液10 μL，混合均勻，在避光條件下孵育5 min。置于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡的變化。

1.7 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移

按1∶10稀釋基質(zhì)膠，吸取60 μL添加至Transwell小室的上室中，2 h后觀察基質(zhì)膠已變成凝膠狀。取Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮并添加300 μL到小室的上室中，細(xì)胞密度為5×105/L。在下室中添加500 μL含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃中孵育培養(yǎng)48 h。取出小室，用甲醇固定，結(jié)晶紫染色以后，在顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)量即為細(xì)胞侵襲數(shù)量。細(xì)胞遷移步驟同上，省去基質(zhì)膠濕化步驟。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測MMP-2、C-Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

取培養(yǎng)48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a細(xì)胞，分別添加細(xì)胞裂解溶液，混合均勻，置于冰上反應(yīng)30 min，以12 000 r/min離心10 min，吸取蛋白溶液，加入到Loading Buffer中混合，煮沸反應(yīng)5 min。配置10%分離膠和6%濃縮膠，每個孔內(nèi)添加40 μg蛋白，打開電源，將電壓調(diào)整為80 V，當(dāng)樣品馬上進(jìn)入分離膠時，將電壓調(diào)整為100 V，電泳約1.5 h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜在冰上進(jìn)行，200 mA電流，將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到NC膜。NC膜置于5%牛血清白蛋白中，室溫孵育90 min，然后置于一抗孵育液中，室溫孵育2 h，最后置于二抗孵育液中，室溫孵育1.5 h。二抗按1∶4 000稀釋，MMP-2、C-Caspase-3抗體分別按1∶1 000和1∶600稀釋。滴加ECL發(fā)光試劑，以GAPDH為參照，分析蛋白表達(dá)變化。

1.9 miR-23a靶基因預(yù)測和鑒定

利用生物信息學(xué)軟件targetscan在線預(yù)測miR-23a的靶基因，發(fā)現(xiàn)SATB2的3′端非編碼區(qū)(3′UTR)與miR-23a有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含有SATB2的3′UTR的野生型熒光素酶報告載體(WT)和突變型熒光素酶報告載體(MUT)，將WT和MUT分別與miR-23a mimics和mimics control共轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，48 h后用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性變化。

1.10 SATB2 siRNA對下調(diào)miR-23a表達(dá)影響SW480細(xì)胞增殖、克隆、凋亡、侵襲和遷移的逆轉(zhuǎn)作用

在SW480細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor、siRNA control和miR-23a inhibitor、SATB2 siRNA，記為Anti-miR-23a+si-NC、Anti-miR-23a+si-SATB2。采用上述CCK-8、平板克隆實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室、Western blot方法檢測細(xì)胞增殖、克隆、凋亡、侵襲和遷移，以及SATB2、MMP-2、C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞中miR-23a mRNA表達(dá)的影響

如表1所示，與Anti-NC組相比，SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細(xì)胞中的miR-23a mRNA相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480細(xì)胞中miR-23a mRNA的表達(dá)。

表1 各組細(xì)胞中miR-23a mRNA相對表達(dá)量的比較()

2.2 miR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞增殖、克隆、凋亡的影響

與Anti-NC組相比，SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細(xì)胞的OD值降低，克隆形成數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見圖1、表2。結(jié)果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480細(xì)胞的增殖、克隆，并可誘導(dǎo)凋亡。

圖1 各組SW480細(xì)胞的凋亡和C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 A 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組SW480細(xì)胞的凋亡 B 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組SW480細(xì)胞中C-Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

表2 各組SW480細(xì)胞的OD值、克隆形成數(shù)量、凋亡率及C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較()

2.3 miR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞侵襲和遷移的影響

與Anti-NC組相比，SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)量減少，細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見圖2、表3。結(jié)果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480細(xì)胞的侵襲和遷移。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組SW480細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)水平

表3 各組SW480細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)量及MMP-2蛋白表達(dá)水平比較()

2.4 miR-23a對SATB2表達(dá)的調(diào)控

靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)，miR-23a與SATB2的3′UTR有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，與mimics control組相比，miR-23a mimics共轉(zhuǎn)染后的WT SW480細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。與Anti-NC組相比，SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a組細(xì)胞的SATB2蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明miR-23a可靶向負(fù)調(diào)控SATB2的表達(dá)。見圖3、表4、表5。

表4 兩組熒光素酶活性比較()

表5 兩組SW480細(xì)胞中SATB2蛋白的表達(dá)水平比較()

圖3 miR-23a靶基因預(yù)測 A miR-23a與SATB2的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn) B 蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組SW480細(xì)胞中SATB2蛋白的表達(dá)水平

2.5 SATB2 siRNA對下調(diào)miR-23a影響SW480細(xì)胞增殖、克隆、凋亡和侵襲遷移的逆轉(zhuǎn)作用

與Anti-miR-23a+si-NC組相比，SW480細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染SATB2 siRNA和miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a+si-SATB2組細(xì)胞的增殖、克隆、侵襲、遷移能力均增強(qiáng)，MMP-2蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平均降低，SATB2蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見圖4、表6。結(jié)果表明SATB2 siRNA可逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-23a表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖、克隆、侵襲、遷移的抑制作用及誘導(dǎo)凋亡作用。

圖4 兩組SW480細(xì)胞的凋亡和C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白表達(dá)水平比較 A 流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組SW480細(xì)胞的凋亡 B 蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組SW480細(xì)胞中C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白的表達(dá)水平

表6 兩組SW480細(xì)胞的OD值、凋亡率、克隆形成、遷移、侵襲數(shù)量及C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白表達(dá)水平比較()

3 討論

miRNA在人類腫瘤中具有十分重要的意義，一些miRNA分子在腫瘤中表達(dá)異常，可能是腫瘤診斷的標(biāo)志物，還有一些miRNA的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。miR-23a是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的調(diào)控分子，對于腫瘤的進(jìn)展具有重要意義[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a參與了細(xì)胞的生長和分化，對于組織炎性反應(yīng)、細(xì)胞代謝具有調(diào)節(jié)作用[11]。miR-23a在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)，并可正向調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[12]。在B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌等組織中也發(fā)現(xiàn)miR-23a呈高表達(dá)[13-14]。CRC相關(guān)研究顯示，miR-23a在腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的臨床分期和浸潤有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miR-23a后的CRC細(xì)胞的增殖、克隆、侵襲和遷移能力下降，細(xì)胞凋亡增多，提示下調(diào)miR-23a具有抵抗CRC細(xì)胞惡性表型的作用，miR-23a在CRC細(xì)胞惡性進(jìn)展中可能發(fā)揮了促進(jìn)作用。

細(xì)胞外基質(zhì)降解是腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處組織轉(zhuǎn)移和浸潤的基礎(chǔ)，而MMP是細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，其有多個家族成員，分別可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的不同組分[15]。MMP-2與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的標(biāo)志物[16]。Caspase是在人體組織中存在的蛋白家族，參與了幾乎所有細(xì)胞的凋亡過程，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡關(guān)系較為密切的蛋白家族[17]。Caspase-3是Caspase家族的凋亡執(zhí)行因子，其活化后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，正常狀態(tài)下以無活性的酶原形式存在[18]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miR-23a后，CRC細(xì)胞中的C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，這說明下調(diào)miR-23a能夠抑制CRC細(xì)胞的侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

miRNA是一類非編碼的RNA，能通過與靶mRNA的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合，從而影響靶基因的翻譯，并且同一個miRNA分子可有多個靶基因，參與不同的組織生理、病理過程[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a可靶向負(fù)調(diào)控SATB2的表達(dá)，miR-23a的作用機(jī)制可能與SATB2有關(guān)。既往研究顯示，SATB2是一個在CRC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的抑癌基因，其可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[20-21]。本研究表明，下調(diào)SATB2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-23a表達(dá)對CRC細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移的抑制及對凋亡的促進(jìn)，說明下調(diào)miR-23a調(diào)控CRC細(xì)胞惡性表型與靶向SATB2有關(guān)。

總之，miR-23a在CRC進(jìn)展中可能發(fā)揮了促癌基因的作用，下調(diào)其表達(dá)可通過靶向上調(diào)SATB2抑制CRC細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，這為研究miR-23a在CRC中的作用機(jī)制提供了參考，為分子靶向治療CRC提供了新思路。本研究僅在SW480細(xì)胞中進(jìn)行了初步探討，今后的研究將在多種CRC細(xì)胞株和體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。