腺病毒介導NAMPT過表達對酒精性脂肪性肝病大鼠的作用及機制研究

周 萌 段超勤 陳志榮

酒精性脂肪性肝病(AFLD)是指由于長期大量飲酒導致的以肝細胞脂肪性病變為主的一類疾病。近年來，隨著中國社會經濟的發展，生活方式和飲食習慣發生了巨大改變，由酒精性肝損傷發展而來的酒精性肝病的發病率呈逐年升高趨勢，AFLD為酒精性肝病的早期階段，對其開展研究十分必要[1-2]。NF-κB是參與炎性反應和免疫應答的重要因子，抑制其表達可改善由乙醇誘導的肝損傷[3]。煙酰胺磷酸核糖轉移酶(NAMPT)在人體的肝臟、骨骼和肌肉組織中廣泛表達，在細胞的代謝、凋亡方面具有重要作用[4-5]。有研究發現NAMPT可下調NF-κB表達，從而抑制炎性反應[6-7]。由此推測，NAMPT可能通過抑制NF-κB介導的炎性反應，從而改善AFLD。本文探究了NAMPT對AFLD的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

本研究選取45只SPF級SD雄性大鼠，體質量為180～220 g，由中國醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SYXK(遼)2018-0014，保持室溫為(25±2)℃，相對濕度為(55±10)%，12 h的晝、夜循環，適應性飼養1周。

1.2 動物模型與分組

45只大鼠適應性飼養1周后，隨機抽取10只作為空白組，給予0.9%氯化鈉溶液，進食普通飼料，持續8周。其余35只大鼠給予乙醇灌胃，采用每3天升高乙醇5%體積分數的方式逐漸從30%增高至55%，同時進食高脂飼料。造模21 d后，隨機抽取5只大鼠，采用H-E染色和油紅O染色觀察大鼠肝臟病理變化，判斷AFLD大鼠模型是否構建成功。然后將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組、空載體組、過表達NAMPT組，每組10只。其中空載體組大鼠在第1、5周于尾靜脈注射200 μL Ubi-EGFP(空載體)，過表達NAMPT組大鼠在第1、5周于尾靜脈注射200 μL NAMPT慢病毒載體[8-9]。采用實時熒光定量PCR(real-time qPCR)法判斷NAMPT是否成功過表達。

1.3 血清學指標檢測

第8周末，各組大鼠禁食不禁水12 h后，摘眼球取血，分離血清，測定肝臟質量，然后取肝組織進行組織勻漿。肝臟指數=肝臟質量/體質量×100%。使用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST水平，試劑盒均購自美國Bio-Swamp公司。

1.4 肝臟組織病理變化

采用H-E染色法觀察大鼠肝臟組織病理變化，采用油紅O染色法觀察大鼠肝臟組織脂肪沉積情況。將固定于4%多聚甲醛溶液中的肝臟組織取出，石蠟包埋切片，之后進行H-E染色和油紅O染色，觀察切片。

1.5 肝臟組織中mRNA相對表達量檢測

采用real-time qPCR法檢測各組大鼠肝臟組織中NAMPTmRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA相對表達量。取大鼠肝臟組織，液氮研磨后加入適量的TRIzol試劑提取RNA，使用PrimeScriptTMRT試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)進行反轉錄，使用PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)進行擴增。采用2-ΔΔCt法計算目的RNA的相對表達量，以β-actin作為內參。引物由沈陽鼎國生物技術有限公司設計，引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.6 肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白水平檢測

采用蛋白質印跡法檢測各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白水平。使用裂解液提取組織總蛋白，利用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后加入適量的上樣緩沖液，沸水浴變性，進行電泳。電泳完畢后轉到PVDF膜上。兔源抗NF-κB、TNF-α單克隆抗體(上海碧云天生物技術有限公司，1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗為山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天生物技術有限公司，1∶2 000)，ECL顯色。應用Image-pro plus 6.0軟件計算半定量蛋白條帶的灰度值，分析蛋白的相對表達情況。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠的一般體征和肝臟指數比較

空白組大鼠的皮毛光滑，行動活躍，體質量增長較快。造模各組大鼠皮毛暗淡，活動減少，對外界刺激反應遲鈍，造模后2周內食欲減退，體質量降低，隨后呈緩慢增長趨勢。與空白組比較，模型組、空載體組和過表達NAMPT組的肝臟質量、肝臟指數均較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)；與模型組和空載體組比較，過表達NAMPT組的肝臟質量、肝臟指數均較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠的肝臟質量和肝臟指數比較

2.2 各組大鼠血清中ALT、AST的表達水平比較

與空白組比較，模型組、空載體組和過表達NAMPT組血清中ALT、AST表達水平均較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達NAMPT組血清中ALT、AST表達水平均較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中ALT、AST的表達水平比較

2.3 各組大鼠肝臟組織的病理變化

光學顯微鏡下可見，空白組大鼠肝臟組織中，各層結構完整，組織連續、排列規則，無明顯脂質沉積；模型組和空載體組大鼠的肝臟各層結構有不同程度的破壞，組織與腺體形態不規則、排列紊亂，可見炎性細胞浸潤，有大量脂質沉積；與空白組比較，過表達NAMPT組大鼠病理變化不明顯，表現為肝臟各層有些許愈合，排列相對整齊，僅可見少量的炎性細胞浸潤和脂質沉積。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理圖像 H-E染色 ×400 A 空白組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達NAMPT組

圖2 各組大鼠肝臟組織病理圖像 油紅O染色 ×400 A 空白組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達NAMPT組

2.4 各組大鼠肝臟組織中NAMPT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA相對表達量比較

與空白組比較，模型組和空載體組肝臟組織中NAMPTmRNA相對表達量較低，NF-κBmRNA和TNF-αmRNA相對表達量較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達NAMPT組肝臟組織中NAMPTmRNA相對表達量較高，NF-κBmRNA和TNF-αmRNA相對表達量較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝臟組織中NAMPT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA水平比較

2.5 各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達水平比較

與空白組比較，模型組、空載體組肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白相對表達量均較高，過表達NAMPT組肝臟組織中NF-κB蛋白相對表達量較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達NAMPT組肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白相對表達量均較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α的蛋白質印跡圖 A 空白組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達NAMPT組

表5 各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白水平比較

3 討論

AFLD是酒精性肝病的早期階段，主要是由于乙醇和代謝產生的氧化物通過多種途徑直接或間接損傷肝臟所致[10-11]。本研究采用乙醇灌胃并給予進食高脂飼料的方式構建AFLD大鼠模型，通過觀察大鼠癥狀、體征、肝臟指數及病理切片可知，AFLD模型構建成功。real-time qPCR法檢測結果可知，過表達NAMPT組肝臟組織中NAMPTmRNA相對表達量高于模型組和空載體組，這提示NAMPT過表達造模成功。本研究結果表明，與模型組和空載體組比較，過表達NAMPT組大鼠的肝臟指數降低，肝臟病理損傷明顯減輕，這提示過表達NAMPT有助于改善AFLD。

NAMPT作為內臟脂肪素，可以抑制多種炎性因子表達，參與機體炎性反應和代謝紊亂[12-13]。NAMPT可調控細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平，并通過調控單核細胞/巨噬細胞的分化、極化和遷移等參與炎癥性腸病的發生和發展[14]。此外，研究表明NAMPT可通過促進基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)、MMP-12和MMP-13的表達參與骨關節炎的發生[15]。另有研究表明，抑制NAMPT表達會靶向沉默信息調節因子1/MAPKα/固醇調節元件結合蛋白1信號轉導通路，加重由高脂飼養誘導的小鼠肝臟脂肪變性[16]。

NF-κB在調控人體炎性反應中扮演著重要角色[17]。研究表明，炎性反應、自身免疫性疾病、感染性休克、病毒感染等均與NF-κB的調控失衡有關，且NF-κB激活的同時會促使TNF-α表達升高[18-20]。本研究通過檢測各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α的mRNA及蛋白表達水平，結果顯示與空白組比較，模型組、空載體組和過表達NAMPT組NF-κBmRNA及蛋白、TNF-αmRNA的相對表達量均較高；與模型組和空載體組比較，過表達NAMPT組NF-κB和TNF-α的mRNA及蛋白的相對表達量均較低。以上結果提示，過表達NAMPT可下調NF-κB和TNF-α的水平，從而抑制炎性反應。

綜上所述，過表達NAMPT可抑制AFLD大鼠的炎性反應，其機制可能與下調NF-κB、TNF-α的表達水平有關。因此，NAMPT有望成為臨床治療AFLD的新靶點，展現出了具有前景的應用價值。